[发明专利]嗜热羧酸酯酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及嗜热羧酸酯酶突变体及其应用。本发明提供的嗜热羧酸酯酶突变体由嗜热乌氏芽孢杆菌的嗜热型羧酸酯酶突变而来，其最适pH为8.0，最适温度60℃，在pH 8.0条件下，70℃的条件下热稳定性良好，60℃孵育60h后，仍保留40％左右的的残留酶活性。且在70℃保温1h，该羧酸酯酶仍具有良好的酶活，适于工业上应用的要求，该突变体在酵母中的表达酶活为387U/mg，其应用空间更广。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及嗜热羧酸酯酶突变体及其应用。

背景技术

羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)作为一种重要的工业酶，可以催化羧酸酯的水解，属于酯酶的一种，基于羧酸酯酶的区域特异性，立体特异性，广泛的底物特异性，反应不需要辅酶并且对有机溶剂具有耐受性，羧酸酯酶成为一种具有吸引力的催化剂。羧酸酯酶属于α/β水解酶家族，水解水溶性的含有酯键的小分子物质，生成产物醇和羧酸。羧基酯酶一般是催化水溶性的较短(10个碳原子)脂肪酸链酯的水解反应(Le L T H L,Yoo W,Jeon S,etal.Characterization and immobilization of a novel SGNH family esterase(LaSGNH1)from Lactobacillus acidophilus NCFM.International Journal ofBiological Macromolecules,2020,21(1):91；Bhatt P,Huang Y,Zhan H,et al.BraultG,Shareck F,Hurtubise Y,et al.Isolation and characterization of EstC,a newcold-active esterase from Streptomyces coelicolor A3(2).PLoS One 2012,7(3):e32041.)。

羧酸酯酶的应用广泛，有几种来源于细菌或真菌的羧酸酯酶已成为商业用途的生物催化剂，广泛应用于各行各业，如食品，制药，化妆品，有机合成，洗涤剂，生物燃料和调味品生产中。

然而，通常的羧酸酯酶进行的催化反应，无法在条件苛刻的环境下进行，例如高温，盐度不合适，pH不适宜，或者强浓度的有机溶剂存在下。因此，需要进行大量的筛选，力求从已有的或者未挖掘的微生物中筛选具有特定性质的羧酸酯酶，或者通过改变现有的羧酸酯酶结构，期待改善其相关的催化性能。例如来源于嗜热芽孢杆菌Bacillusthermocloaceae的羧酸酯酶Est5250，对各种有机溶剂有很强的耐受性(Yang Y,Ghatge S,Hur H G.Characterization of a novel thermostable carboxylesterase fromthermoalkaliphilic bacterium Bacillus thermocloaceae.Biosci.Biotech.Bioch.2019,83(5):882-891)。

但目前，由于过量或不规范使用农药，导致农药的残留或者超标，严重污染环境甚至危害生物的生存。而在农药的降解中，酶反应的环境通常是苛刻的，因此，进一步研究具有良好耐受性的嗜热羧酸酯酶存在重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供了稳定性良好的嗜热羧酸酯酶突变体及其应用。

本发明提供的嗜热羧酸酯酶突变体，其在如SEQ ID NO:1所示野生型的氨基酸序列中第160的蛋氨酸突变为赖氨酸。

在本发明中，所述嗜热羧酸酯酶突变体被记做Est₇₄₁，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该突变体来源于嗜热乌氏芽孢杆菌的羧酸酯酶，相对于野生型而言，稳定性更强、酶活更高。该羧酸酯酶突变体在高温下的高催化特性与良好稳定性，在工业上有着广泛的应用前景。

本发明还提供了编码嗜热羧酸酯酶突变体Est₇₄₁的核酸。