[发明专利]一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法与应用

说明书

本发明提供一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法与应用，该突变体重组蛋白是将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第66位由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，第102位由谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)，并在氨基酸序列C端连接氨基酸序列“QDRLRKKE”。重组蛋白的制备方法包括：将上述猪干扰素α17突变体两端引入酶切位点后合成；将合成的片段和pVB220质粒进行酶切后纯化并用T4连接酶连接；转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，接种培养；将包涵重组表达质粒菌落进行温度诱导表达；培养结束后将菌液离心，收集菌体；将菌体进行超声破碎后，重悬浮包涵体，并进行分离纯化，即得。该重组蛋白应用于抗VSV或抗PRV药物或疫苗制备。

技术领域

本发明属于基因改造技术领域，具体涉及一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法与应用。

背景技术

干扰素(interferon,IFN)是一类具有抑制肿瘤形成、抗病毒、免疫调节和调节细胞生长等生物学功能的细胞因子。根据其生物学活性和抗原活性分为三类：第一类是由病毒诱导白细胞产生的α干扰素(IFN-α)；第二类是由病毒诱导纤维母细胞产生的β干扰素(IFN-β)，与α干扰素(IFN-α)具有共同的表面受体，都属于Ⅰ型干扰素；第三类是由病毒诱导淋巴细胞产生的γ干扰素(IFN-γ)，与α干扰素(IFN-α)、β干扰素(IFN-β)的表面受体不同，属于Ⅱ型干扰素。其中Ⅰ型干扰素具有较强的抗病毒功能，Ⅱ型干扰素抗病毒功能稍弱，但免疫调节功能较强。

猪的Ⅰ型干扰素主要包括IFN-α和IFN-β，其中目前发现猪的IFN-α有17个亚型，而IFN-β只有1个亚型。不同的猪IFN-α亚型序列的同源性较高，但由于不同干扰素亚型结构上的差异导致其抗病毒活性和其他生物活性(抗病毒活性、抗炎活性、MHC调节、复制性T细胞的调节)存在差异。尽管目前已开发出部分干扰素产品应用于猪传染性疫病的预防与治疗，但猪干扰素的临床应用仍然存在体内半衰期短、需要大剂量频繁给药、全身毒副作用强等问题，从而使其临床应用具有较多的局限性。因此，进一步开发新一代的高活性、低毒长效的干扰素用于临床疫病防治具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法与应用以解决上述问题。本发明的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种猪干扰素α17突变体重组蛋白，是将SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列中第66位由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，第102位由谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)，并在氨基酸序列C端连接氨基酸序列“QDRLRKKE”，所述突变体的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

第二个方面，本发明提供一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将上述猪干扰素α17突变体蛋白两端引入限制性内切酶BamH I和HindⅢI酶切位点后进行基因合成，得到IFN-α17基因片段；

(2)将所述IFN-α17突变体基因片段和pVB220质粒用限制性内切酶BamHI、HindⅢ酶切后纯化，纯化后的基因片段用T4连接酶连接；

(3)将T4连接酶连接后的基因片段转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，接种含氨苄的LB培养基培养，提取质粒后进行酶切鉴定，并将鉴定的阳性质粒测序，获得重组表达质粒pVB220-poIFN-α17-7m；

(4)将重组表达质粒pVB220-poIFN-α17-7m菌落接种至含氨苄的LB培养基进行温度诱导表达；

(5)培养结束后将菌液离心，收集菌体，弃上清，加入中性PBS多次洗涤菌体，离心后将菌体在缓冲液中悬浮混匀，加入PMSF和溶菌酶，冰上孵育一段时间；

(6)将菌体进行超声破碎后加入裂解液悬浮包涵体，并进行分离纯化，即得。