[发明专利]一种山羊胰腺腺泡细胞的分离培养及鉴定方法

说明书

本发明公开了一种山羊胰腺腺泡细胞的分离培养及鉴定方法，所述方法包括如下步骤：（1）将1‑3mm³山羊胰腺组织清洗后离心，弃上清，然后向离心后的沉淀中添加消化液进行山羊胰腺组织消化处理；（2）终止消化后，离心并弃上清，用原代培养基混匀离心后的沉淀，得山羊胰腺腺泡悬液；（3）依次采用差时消化、差时贴壁及细胞刮取的方式对山羊胰腺腺泡细胞悬液中的山羊胰腺腺泡细胞进行纯化处理；（4）将纯化处理后所得的山羊胰腺腺泡细胞接种至传代培养基中进行传代培养；（5）对传代培养后的山羊胰腺腺泡细胞进行鉴定。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种山羊胰腺腺泡细胞的分离培养及鉴定方法。

背景技术

反刍动物小肠内过瘤胃营养物质的消化受到胰腺外分泌功能的限制，尤其以胰腺淀粉酶分泌不足导致40％的过瘤胃淀粉消化不完全，表现出胰腺外分泌功能不足。开展胰腺腺泡细胞分离培养工作对于进一步从细胞分泌、配体结合、底物摄取、蛋白质合成或第二代信使等角度解析反刍动物胰腺外分泌不足机制，并建立可能的营养调控策略具有重要意义。

在细胞水平上对胰腺外分泌功能的探索始于20世纪70年代。并已逐步建立了各类动物的胰腺腺泡细胞分离方法，包括人、猪、牛和鼠等。然而，目前尚未见山羊胰腺腺泡细胞的原代细胞分离和培养方法相关报道。且在已有的培养方法中，消化各动物胰腺腺泡细胞所使用的消化酶和消化时间各有不同，鉴定工作也鲜有报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种山羊胰腺腺泡细胞的分离培养及鉴定方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述山羊胰腺腺泡细胞的分离培养及鉴定方法包括如下步骤：

(1)将1-3mm³山羊胰腺组织清洗后离心，弃上清，然后向离心后的沉淀中添加消化液进行山羊胰腺组织消化处理；所述沉淀与消化液的质量体积比为1g/10mL；所述消化液由DMEM/F12培养基中添加胶原酶Ⅳ和EGTA配制而成，所述胶原酶Ⅳ在DMEM/F12培养基中的浓度为1mg/mL，所述EGTA在DMEM/F12培养基中的浓度为0.001mol/mL；

(2)终止消化后，离心并弃上清，用原代培养基混匀离心后的沉淀，得山羊胰腺腺泡悬液；所述沉淀与原代培养基的质量体积比为1g/5mL；所述原代培养基由DMEM/F12培养基中添加FBS、青链霉素混合液、庆大霉素、两性霉素、胰岛素和EGF配制而成，所述FBS、青链霉素混合液、庆大霉素、两性霉素、胰岛素和EGF在DMEM/F12培养基中的浓度或体积百分比浓度分别为：10％、10％青链霉素混合液、2.5μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL和10ng/mL；

(3)依次采用差时消化、差时贴壁及细胞刮取的方式对山羊胰腺腺泡细胞悬液中的山羊胰腺腺泡细胞进行纯化处理；

(4)将纯化处理后所得的山羊胰腺腺泡细胞接种至传代培养基中进行传代培养；所述传代培养基由DMEM/F12培养基中添加FBS、青链霉素混合液、庆大霉素、两性霉素、胰岛素和EGF配制而成，所述FBS、青链霉素混合液、庆大霉素、两性霉素、胰岛素和EGF在DMEM/F12培养基中的浓度或体积百分比浓度分别为：10％、2％青链霉素混合液、2.5μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL和10ng/mL；

(5)对传代培养后的山羊胰腺腺泡细胞进行鉴定。

优选地，步骤(1)中所述的消化处理是于37℃、80rpm/min条件下摇床消化时间为20min。

优选地，步骤(1)中所述的离心条件是1000rpm/min离心5min；步骤(2)中所述的离心条件是600g/min离心5min。

优选地，步骤(2)中所述的终止消化是用含有FBS的DMEM/F12培养基中培养基终止，所述DMEM/F12培养基中的体积百分比浓度为10％。