[发明专利]斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用

说明书

本发明提供了斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用，涉及基因工程技术领域。本发明提供了用于特异性敲除斑马鱼cyp21a2基因的sgRNA，通过CRISPR/Cas9技术构建并选育出cyp21a2基因缺失型斑马鱼，获得了斑马鱼排卵障碍模型。本发明所构建的斑马鱼排卵障碍模型同时具备高雄激素和高促黄体激素的内分泌特征，为深入解析内分泌激素调控排卵机制研究提供了良好的模型材料。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用。

背景技术

排卵障碍包括稀发排卵和无排卵，占不孕症患者病因的25％，其病因复杂，准确定位及评估排卵障碍发病机制是有效治疗的关键(闫阳等，2021)。内分泌失调是多种排卵障碍的主要表现，包括以高雄激素为特征的多囊卵巢综合征，和以高促黄体激素为特征的卵巢不敏感综合征(Ruan X等，2018；Manna PR等，2016和Zhang Y等，2018)。这些疾病的发病机制复杂，涉及途径繁多，因此，不孕模型的成功构建为明确该类疾病的致病原因、早期诊断和治疗奠定了基础。

cyp21a基因定位于人类6p21.3，有真基因和假基因两个基因组成。cyp21a基因为编码21羟化酶的功能基因，该酶催化17-羟孕酮(17-OHP)转化为11-脱氧皮质醇，同时催化孕酮转化为11-脱氧皮质酮，二者分别是皮质醇和醛固酮的前体。

21羟化酶活性降低致使皮质醇和醛固酮合成受损，最终导致高雄激素血症，临床上表现为女性男性化、不育等症状(例如先天性肾上腺皮质增生症，CAH)。目前，为了研究由cyp21a基因突变引起的CAH即先天性肾上腺皮质增生症21羟化酶缺乏型(21OHD)，人们构建了21OHD老鼠模型和利用TALEN法构建的cyp21a基因突变斑马鱼模型(TOSHIHIRO TAJIMA等，1999；M Perdomini等，2017和Helen Eachus等，2017)，而老鼠模型存在很难养活的问题，斑马鱼模型存在尚未出现排卵障碍性状的问题。因此，有必要继续研究和开发cyp21a基因突变相关的排卵障碍模型，为排卵障碍发病机制的研究提供基础。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高LH和T激素内分泌特征的排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用。本发明提供了用于特异性敲除斑马鱼cyp21a2基因的sgRNA，通过CRISPR/Cas9技术构建并选育出cyp21a2基因缺失型斑马鱼，获得了斑马鱼排卵障碍模型。本发明所构建的斑马鱼排卵障碍模型同时具备高雄激素(T)和高促黄体激素素(LH)的内分泌特征，为深入解析内分泌激素调控排卵机制研究提供了良好的模型材料。

本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了用于斑马鱼cyp21a2基因敲除的sgRNA，所述sgRNA的DNA序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

本发明中提供的sgRNA是基于CRISPR/Cas9技术，特异性敲除斑马鱼cyp21a2基因构建斑马鱼排卵障碍模型的sgRNA。

在另一个方面，本发明提供了一种CRISPR/Cas9组合物，所述组合物包含前述sgRNA或编码权利要求1前述sgRNA的DNA，以及Cas9蛋白。

在本发明中，本发明还涵盖包含前述的靶向斑马鱼cyp21a2基因的sgRNA或前述的CRISPR/Cas9组合物的试剂盒等相关检测产品。

在另一个方面，本发明提供了前述的sgRNA或前述的CRISPR/Cas9组合物在制备斑马鱼排卵障碍模型的应用；优选地，所述应用为在构建斑马鱼高雄激素和高促黄体激素不孕模型中的应用。

本发明利用设计的sgRNA与Cas9蛋白的组合物进行基因编辑，获得了敲除斑马鱼cyp21a2基因的斑马鱼突变体，即斑马鱼模型，该斑马鱼模型具有排卵障碍，特别是高雄激素和高促黄体激素型排卵障碍。