[发明专利]一种类睾丸器官的制备、培养、冻存复苏方法及应用

权利要求书

1.一种睾丸类器官，其包含：间质细胞、支持细胞、精原干细胞或它们的组合。

2.根据权利要求1所述的睾丸类器官，其为通过体外细胞培养获得的，并且能够生成睾酮，优选所述细胞是来源于啮齿动物或非人灵长类动物，小鼠或大鼠，最优选所述细胞使用的是成体细胞，优选是3天至2周大、特别优选7～10天大的动物的睾丸组织胰酶消化后得到的细胞集合。

3.根据权利要求1或2所述的睾丸类器官，其表达以下蛋白标志物之一或它们的组合：纤连蛋白，α-SMA，ZO-1，WT1，Star，和PCNA。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的睾丸类器官，其能够表达以下基因之一或它们的组合：Hsd3b1，Hsd17b3，Star，Sox9，Wt1，Ar，Fshr，C-ret，和Crem。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的睾丸类器官，其能够分泌以下因子之一或它们的组合：Amh，Dhh，Gdnf，抑制素B，Cxcl12和Fgf2。

6.一种用于制备睾丸类器官的方法，其包括以下步骤：

1)获得幼年动物睾丸细胞，优选所述细胞是成体细胞，更优选是3天至2周大、特别优选7～10天大的动物的睾丸组织消化后得到的细胞集合；

2)将获得的睾丸细胞进行悬滴培养；和任选地

3)将步骤2)中获得的悬滴培养产物进行悬浮培养，由此获得睾丸类器官。

7.根据权利要求6所述的方法，其中：

a)所述动物为啮齿动物或非人灵长类动物，小鼠或大鼠；

b)在步骤1)中，取幼年动物睾丸组织，依次进行浸泡、洗涤、去被膜、剪切和细胞消化，获得幼年动物睾丸细胞，其中优选地，所述浸泡使用PBS浸泡；和/或所述洗涤中使用的洗涤液为含有青霉素和链霉素的PBS；优选地，所述消化是使用胰酶消化；

c)在步骤2)中，所述悬滴培养使用的培养基是含有EGF的无血清培养基(优选DMEM，MEM、DMEM/F12培养基)，诸如含有EGF和KSR的基础培养基，并且于34℃-37℃、3％-5％CO₂浓度的培养条件下悬滴培养5-7天，优选按所述培养基的体积计，培养基中EGF的浓度为50-100ng/ml，KSR浓度为5-10体积％；和/或

d)在步骤3)中，所述悬浮培养使用的培养基是含有KSR、LH和FSH的基础培养基(优选DMEM，MEM、DMEM/F12培养基)，优选按培养基的体积计，各成分的含量为：KSR，5体积％-10体积％；LH，1-10ng/ml；FSH，1-10ng/ml；和/或优选地，将步骤2)中获得的悬滴培养产物离心富集细胞，加入上述培养基，于34℃-37℃、3％-5％CO₂、120-160rpm下培养。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的睾丸类器官，其可通过根据权利要求6或7所述的方法制备。

9.根据权利要求1-5和8中任一项所述的睾丸类器官在药物筛选或测定药物毒性中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中将候选药物与根据权利要求1-5和8中任一项所述的睾丸类器官接触。