[发明专利]一种重组鸭3型腺病毒fiber-2基因的表达方法

说明书

本发明提供了一种重组鸭3型腺病毒fiber‑2基因在马克斯克鲁维酵母表达系统中的表达方法，该方法先将优化后的鸭3型腺病毒fiber‑2基因连接至表达质粒pUKD‑N115中，然后将连接产物转化至尿嘧啶缺失型马克斯克鲁维酵母菌TOP1中表达，最后获得了表达鸭3型腺病毒fiber‑2蛋白的重组酵母菌。本发明成功实现了重组质粒在马克斯克鲁维酵母中的高效表达，且含该表达产物的疫苗在对番鸭的腺病毒感染实验上取得了一定的保护效果。

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体是涉及一种鸭3型腺病毒fiber-2基因的表达方法。

背景技术

腺病毒是一种无囊膜的线状双股DNA病毒，直径为70～90nm，呈正十二面体对称。衣壳由252个壳粒呈廿面体排列构成，每个壳粒的直径为7～9nm。两端各有长约100bp的反向重复序列。由于它们倾向于感染上皮细胞而被命名为腺病毒。自上个世纪五十年代分离到第一株腺病毒(adenovirus，ADV)起，陆续从许多脊椎动物身上都分离出腺病毒。根据宿主范围的不同，目前将腺病毒划分为五个属，哺乳动物ADV属(Mastadenovirus)、禽类ADV属(Aviadenovirus)、富AT ADV属(Atadenovirus)、唾液酸酶ADV属(Siadenovirus)美洲白鲟腺病毒属(Ichtadenovirus)。目前已报道的对鸭有致病性的腺病毒包括：鸭腺病毒1型(Dadv-1)、鸭腺病毒2型(Dadv2)和鸭腺病毒3型(Dadv-3)，其中Dadv-3于2014年分离于广东一批患病番鸭，其临床病理表现为肝纤维化、肿大，心包积液。Dadv-3对四十日龄内雏番鸭有严重的致病性，对家禽养殖造成的重大的危害，由于缺乏有效的针对Dadv-3的商品化疫苗，因此开发出一款经济、安全、有效的疫苗迫在眉睫。

采用外源蛋白表达的手段，能够为商品化疫苗等生物制品的规模化生产提供技术支持，其中，酵母表达系统不仅具有原核表达系统生长快、培养基廉价、易维持、易规模化等优点，同时也具有真核表达系统的优点，如蛋白加工、蛋白折叠、适合大规模生产等。但另一方面，酵母表达系统也具有过渡糖基化，酵母系统在将蛋白质分泌到生长培养基中时效率低下，导致蛋白质在细胞内滞留，难以纯化等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种重组鸭3型腺病毒fiber-2基因的表达方法。

本发明的目的还在于克服传统的表达方法表达量不高、表达菌株不稳定、质粒易丢失、过度糖基化等技术缺陷。

为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组鸭3型腺病毒fiber-2基因的表达方法，该方法中重组鸭3型腺病毒fiber-2的基因序列如SEQ NO 1所示。

进一步的，所述方法是通过尿嘧啶缺陷型马克斯克鲁维酵母工程菌构建的表达系统进行表达的。

所述表达方法采用的表达载体为pUKD-N115。

进一步的，所述表达方法包括以下步骤：

1)将鸭3型腺病毒fiber-2基因按照尿嘧啶缺陷型马克斯克鲁维酵母偏爱密码子进行序列优化；

2)将重组鸭3型腺病毒fiber-2基因与载体pUKD-N115连接；

3)将连接产物转化到马克斯克鲁维酵母TOP1中进行表达；

4)获取表达后产物TOP-DAdV-3并进行鉴定；

5)高密度发酵TOP-DAdV-3，获得重组菌液；

6)对重组菌液进行纯化，制备成重组蛋白。

进一步的，步骤2)的载体pUKD-N115经SmaI、NotI双酶切后进行连接。