[发明专利]检测溶藻弧菌的RPA-IAC引物、试剂盒、应用及其方法

权利要求书

1.检测溶藻弧菌的RPA引物对及扩增内标组合，其特征在于：所述RPA引物对的核苷酸序列为：

collagenasecollagenase-F：5′- GCTTATCGAGTCGATGCGCCTGACAAGTGATC -3′；

collagenasecollagenase-R：5′- TCATAAGGGTCCCGTATGCGTACTTGCTAT -3′；

所述所述扩增内标的5′端为collagenasecollagenase-F，3′为collagenasecollagenase-R的反向互补序列，中间为异种保守基因的至少部分连续序列。

2.根据权利要求1所述的RPA引物对及扩增内标组合，其特征在于：所述异种保守基因的至少部分连续序列长度为250～320 bp。

3.根据权利要求2所述的RPA引物对及扩增内标组合，其特征在于：所述异种保守基因的至少部分连续序列的核苷酸序列为gttcgagaccttcaacaccccagccatgtacgtggccatccaggcggtgctgtccctgtacgcctctggccgcaccactggcatcgtgatggactccggagacggggtcacccacacggtgcccatctacgaggggtacgccctgccccacgccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgaccgactacctcatgaagatcctgacggagcggggctacagcttcaccaccacggccgagcgggagatcgtgcgggacatcaagg。

4.根据权利要求1～3任一项所述的RPA引物对及扩增内标组合，其特征在于：所述扩增内标插入在质粒内。

5.一种检测溶藻弧菌的试剂盒，其特征在于：其包括权利要求1～4任一项所述的RPA引物对及扩增内标组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括以下组分中的至少一种：

RPA恒温扩增试剂；

DNA提取试剂；

阳性对照和阴性对照。

7.权利要求1～4任一项所述的引物对及扩增内标组合在制备溶藻弧菌检测试剂中的应用。

8.一种检测溶藻弧菌的RPA-IAC方法，其特征在于：

S1)获得待测样本的DNA或RNA；

S2)使用权利要求1～4任一项所述的引物对及扩增内标组合，进行RPA-IAC扩增；

S3)基于RPA-IAC扩增结果，确定样本中是否存在溶藻弧菌。

9.根据权利要求8所述的RPA-IAC方法，其特征在于：所述待测样本为贝类水产品。

10.根据权利要求8或9所述的RPA-IAC方法，其特征在于：RPA-IAC扩增反应的体系为：

含有冻干酶粉的0.2 mL TwistAmp 反应管

再水化缓冲液 29.5 μL

RPA引物对 终浓度均为0.4 μmol/L

含有扩增内标的质粒 1.83×10³ copies

模板DNA 50 ng

醋酸镁溶液 2.5 μL，浓度为280 mmol/L

去离子水 补足至50 μL；和/或

RPA-IAC扩增反应的反应条件为37℃反应40 min。