[发明专利]抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法

说明书

本发明公开了一种抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法，是通过在茂源链霉菌IPIO中，利用CRISPRi技术弱化茂源链霉菌IPIO中非必需高丰度蛋白编码基因的转录水平，得到高产谷氨酰胺转氨酶的突变株。本发明通过降低高丰度蛋白编码基因SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989和SMDS_6427的转录水平，抑制了这些蛋白的合成，减轻TG酶合成过程中的氨基酸前体竞争压力，以此来提高谷氨酰胺转氨酶的发酵水平。本发明所得的工程菌株的谷氨酰胺转氨酶发酵产量在实验室摇瓶水平下较对照菌株分别提高37％、35％、46％和32％。通过本发明可显著提高谷氨酰胺转氨酶的发酵产量，同时大幅度降低发酵成本。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种利用CRISPRi技术降低SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989 和SMDS_6427的转录水平，抑制上述4种高丰度非必需蛋白的表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(TG酶)是由茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质，被广泛应用于食品行业蛋白制品食用添加剂、交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物、提高羊毛纺织品的强度等，市场需求量逐年上升，然而目前该酶产量仍然较低，亟待进一步提升。本发明发现，在茂源链霉菌生产TG酶的过程中，胞内胞外存在其他一些高丰度蛋白质，通过分别抑制其中非必需高丰度蛋白的表达，能够减轻TG酶合成过程中氨基酸前体的竞争压力，进而提高了TG酶的产量。进一步的，本发明通过蛋白质组学发现 SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989和SMDS_6427蛋白丰度较高且基因功能非必需，利用CRISPRi技术降低上述基因的转录水平，抑制其非必需高丰度蛋白的表达可以减轻 TG酶合成过程中对氨基酸前体的竞争压力，增加TG酶合成过程中的氨基酸供应，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种抑制高丰度非必需蛋白SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989和 SMDS_6427表达的方法；通过在茂源链霉菌IPIO中利用CRISPRi技术降低SMDS_5177、 SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427的转录水平，抑制SMDS_5177、SMDS_758、 SMDS_5989和SMDS_6427表达，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种TG酶高产菌株，所述菌株的非必需高丰度蛋白编码基因转录被抑制。

作为本发明的一个实施方案，所述菌株的谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶抑制蛋白、短杆菌肽合酶C亚基蛋白、苦霉素合酶模块3和4蛋白或促自溶诱导蛋白表达被抑制。具体是在茂源链霉菌中(通过CRISPRi技术)分别抑制了高丰度非必需蛋白编码基因 SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427的转录水平。分别抑制了蛋白的表达，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。

作为本发明的一个实施方案，所述茂源链霉菌为茂源链霉菌IPIO。

第二方面，本发明提供一种用于降低蛋白编码基因转录水平的整合型质粒载体，所述载体分别降低了非必需高丰度蛋白编码基因SMDS_5177(谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶抑制蛋白编码基因)、SMDS_758(短杆菌肽合酶C亚基蛋白编码基因)、SMDS_5989 (苦霉素合酶模块3和4蛋白编码基因)、SMDS_6427(促自溶诱导蛋白编码基因)的转录水平，含有靶向以上4个基因启动子区域的sgRNA，通过降低基因转录水平抑制蛋白表达。

作为本发明的一个实施方案，所述非必需高丰度蛋白编码基因源于茂源链霉菌IPIO。