[发明专利]抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法

权利要求书

1.一种TG酶高产菌株，其特征在于，所述菌株的非必需高丰度蛋白编码基因转录被抑制。

2.如权利要求1所述的TG酶高产菌株，其特征在于，在茂源链霉菌IPIO中通过CRISPRi技术分别降低了基因SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427的转录水平。

3.一种用于降低蛋白编码基因转录水平的整合型质粒载体，其特征在于，所述载体分别抑制了茂源链霉菌IPIO的谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶抑制蛋白编码基因SMDS_5177、短杆菌肽合酶C亚基蛋白编码基因SMDS_758、苦霉素合酶模块3和4蛋白编码基因SMDS_5989、促自溶诱导蛋白编码基因SMDS_6427的转录水平，含有靶向以上4个基因启动子区域的gRNA，通过降低基因转录水平抑制蛋白表达。

4.根据权利要求3所述的整合型质粒载体，其特征在于，所述基因SMDS_5177的序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的gRNA_{SMDS_5177}的序列如SEQ ID NO.2所示；所述SMDS_758的序列如SEQ ID NO.3所示，其对应的gRNA_{SMDS_5989}的序列如SEQ ID NO.4所示；所述基因SMDS_5989的序列如SEQ ID NO.5所示，其对应的gRNA_{SMDS_5989}的序列如SEQ ID NO.6所示；所述基因SMDS_6427的序列如SEQ ID NO.7所示，其对应的gRNA_{SMDS_6427}的序列如SEQ ID NO.8所示。

5.一种根据权利要求3或4所述的整合型质粒载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

在CRISPy-web网站上设计特异性靶向SMDS_5177启动子区域的gRNA，通过PCR扩增得到含sgRNA_{SMDS_5177}基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2103；

或，在CRISPy-web网站上设计特异性靶向SMDS_758启动子区域的gRNA，通过PCR扩增得到含sgRNA_{SMDS_758}基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2104；

或，在CRISPy-web网站上设计特异性靶向SMDS_5989启动子区域的gRNA，通过PCR扩增得到含sgRNA_{SMDS_5989}基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2105；

或，在CRISPy-web网站上设计特异性靶向SMDS_6427启动子区域的gRNA，通过PCR扩增得到含sgRNA_{SMDS_6427}基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET-dCas9-actII4-NT-S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2106。

6.一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，其特征在于，将如权利要求3或4所述的整合型质粒载体，或如权利要求5所述的方法构建得到的整合型质粒载体，通过接合转移分别导入受体菌茂源链霉菌IPIO中进行位点特异性重组，获得所述菌株。

7.一种提高谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于，分别通过CRISPRi技术降低茂源链霉菌中SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427的转录水平。