[发明专利]一种快速检测牛结核病的方法

说明书

本发明公开了一种通用快速检测牛结核病的引物、探针及检测方法，其中引物和探针适用于RAA荧光法检测，可实现在39℃条件下20分钟内完成动物布鲁氏菌核酸的检测；与猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、布鲁氏菌核酸样本无交叉反应，特异性达100％；检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明提供的基于RAA荧光法通用快速检测牛结核病病原的方法，灵敏度高，反应检测灵敏度在95％的概率下达到66copies/反应。

技术领域

本发明属于细菌分子生物学检测技术领域，具体涉及一种对牛结核病病原的快速检测方法。

背景技术

牛结核病(Bovine Tuberculosis，bTB)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，M.bovis)等引起的一种人兽共患的慢性传染病，我国将其列为二类动物疫病。以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的动物疫病(notifiable diseases)。2012年，我国发布《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》，将牛结核病列为16种优先防治动物疫病病种。《国家奶牛结核病防治指导意见(2017-2020年)》进一步提出了牛结核病的控制目标。据估计，全世界有超过5000万头牛感染，每年耗费30亿美元。人通过食用未经消毒的牛奶或与患病动物接触，感染牛结核病。

牛结核病通常呈慢性经过，潜伏期在半月至数年不等。大多数情况下，细菌以休眠状态潜伏在动物体内，不引起任何临床症状，表现为潜伏感染。有的动物在感染几个月甚至数年后，才出现明显的临床症状，发展为活动性结核。牛结核病病原菌会侵染易感动物几乎所有的组织器官，因患病器官不同，表现出来的临床症状亦不同。整体上，患病动物表现出明显的食欲不振，顽固性腹泻，渐进性消瘦，易疲劳，偶尔出现波浪热，间歇性咳嗽，部分个体伴随淋巴结肿大。全国牛结核病专项调查显示，其感染率波动上升趋势，屠宰环节的检出率更高。奶牛结核病高感染率严重威胁奶业安全和公共卫生安全，其控制净化工作任务非常艰巨。受制于检测技术的瓶颈，我国牛结核病检测的需求，特别是在现场快速检测的需求缺口越来越大。因此，加强牛结核病检测技术研究，为疫病的控制、净化，动物健康，公共卫生安全具有重要意义。

目前对牛结核病的诊断方法有如下的几种：

1)临床诊断

牛结核病以肺结核最为常见，其次是乳房结核和肠结核，以及淋巴结核、胸膜结核和腹膜结核，有时可见肝、脾、肾、生殖器官、脑、骨和关节结核，严重者可表现为全身性粟粒性结核。根据感染累及器官不同，通常可见呼吸症状、腹泻、泌乳减少、生殖性能紊乱、神经症状等。

2)实验室诊断