[发明专利]一种快速检测斑马鱼线粒体细胞色素氧化酶活力的方法及应用

说明书

本发明提供一种快速检测斑马鱼线粒体细胞色素氧化酶活力的方法及应用。细胞色素氧化酶(COX)位于真核生物的细胞线粒体上，是氧化磷酸化的重要复合物，其活力高低可以反映线粒体活力状态。本方法基于细胞色素氧化酶催化3,3‑二氨基联苯胺使其氧化形成棕褐色不溶性产物，从而根据颜色的深浅反映COX活力的高低。近些年来，由于斑马鱼发育迅速、产卵量大、饲养简单、胚胎透明等优势，已经成为线粒体相关疾病研究最受欢迎的模式动物之一。本发明相比现有技术，实现了快速、简单、高效地对斑马鱼幼鱼整体进行线粒体COX活力评估，能够十分方便观察遗传或环境因素造成特异性组织线粒体活力改变，且对设备及环境要求低，有利于推广和应用。

技术领域

本发明属于生命科学与生物技术领域，涉及一种快速检测斑马鱼线粒体细胞色素氧化酶活力的方法及应用。

背景技术

线粒体病是由遗传缺陷引起线粒体氧化磷酸化系统异常，致使ATP合成障碍、能量不足导致广泛临床表现的一类可遗传疾病。线粒体拥有自已独立的环形基因组(mtDNA)，含37个编码基因，能够编码22种转运RNA(tRNA)，2种核糖体RNA(rRNA)以及13种蛋白，这些蛋白都是电子传递链上复合物的亚基。但是目前蛋白质组学研究已经鉴定和预测超过 1000种与哺乳动物线粒体相关的蛋白质，并且这些蛋白质大多是由核基因编码的。因此，线粒体DNA或是编码线粒体蛋白的核基因突变都有可能造成线粒体损伤，引起线粒体疾病。近些年，斑马鱼(Danio rerio)由于发育快，产卵量大；饲养简单，维护成本低；体外受精，胚胎透明；与人线粒体序列高度相似等优势，成为人类线粒体疾病研究的理想动物模型。

细胞色素氧化酶位于真核生物的细胞线粒体上，是线粒体标志酶之一，常作为细胞内氧化磷酸化代谢的指标，在含有大量线粒体的细胞中都有很高的活性。目前，对于评估斑马鱼组织线粒体COX酶活常用的方法是先将斑马鱼幼鱼进行冷冻包埋切片，然后再添加COX 染色反应试剂进行染色。此方法检测斑马鱼组织酶活的实验流程比较繁琐，样本量检测也比较有限，难以快速并大规模的评估遗传因素或环境因素对斑马鱼组织线粒体活力的影响。因此，开发高效、快速、高特异性的COX活力检测方法对于基础研究中快速判断斑马鱼幼鱼组织线粒体活力情况变得至关重要。

发明内容

本发明的目的是针对目前检测斑马鱼线粒体细胞色素氧化酶(COX)活力的缺点，提供一种可整体快速检测斑马鱼线粒体COX的活力方法，该方法具有高效、快速、高通量、经济等特点。本发明可以成为基础研究领域评估利用斑马鱼模型模拟线粒体疾病的一种快速鉴别方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：首先分别收集野生型和某些因素处理 (遗传或环境因素)的斑马鱼幼鱼(4-20天)，麻醉后用10％甲醛固定，0.1％TritonX-100通透，加入COX染色剂，28℃避光孵育，体式显微镜拍照并分析染色结果。具体通过以下步骤实现：

(1)制作简易筛网

将50ml离心管去掉盖子，将管口较粗的部分放酒精灯上均匀燃烧1-2mm，快速倒扣在尼龙网滤布上(100目)，用剪刀沿着管口裁剪滤布；用酒精灯烧红手术刀，在离心管口10cm 左右的位置进行切割，就可以完成简易筛网的制作。所制作的简易筛网可以快速的进行溶液的转换，保证不同幼鱼之间的操作时间是一致的。

(2)配置COX染色试剂

COX试剂配方为5mM磷酸盐缓冲液，0.1％3,3-二氨基联苯胺(DAB)，0.1％细胞色素C，0.02％过氧化氢酶。最后调pH为7.4，并用滤纸过滤。

(3)斑马鱼幼鱼的饲养和收集

收集野生型和某些因素(遗传和环境)处理的4-20天斑马鱼幼鱼，幼鱼前5天不需要进食，5天后需要每天喂食草履虫。

(4)COX染色前幼鱼的预处理