[发明专利]一种快速检测斑马鱼线粒体细胞色素氧化酶活力的方法及应用

权利要求书

1.一种快速检测斑马鱼线粒体细胞色素氧化酶活力的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)制作简易筛网；

(2)配置COX染色反应试剂；

(3)斑马鱼幼鱼的饲养和收集；

(4)COX染色前幼鱼的预处理；

(5)添加COX染色试剂；

(6)COX染色后处理；

(7)使用体式显微镜对COX染色的幼鱼进行拍照，比较幼鱼组织棕色深浅的变化；

(8)如果需要观察幼鱼组织显微结构COX活力，利用冰冻切片法进一步分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)简易筛网的制作通过以下步骤实现：

(1)准备如下工具：50ml离心管、手术刀、100目尼龙网滤布、酒精灯、剪刀；

(2)将50ml离心管去掉盖子，将管口较粗的部分放酒精灯上均匀燃烧1-2mm，快速倒扣在尼龙网滤布上，最后用剪刀沿着管口裁剪滤布；

(3)用酒精灯烧红手术刀，在离心管口10cm左右的位置快速进行切割，即完成简易筛网制作。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)COX试剂配置方法为：取5mM磷酸盐缓冲液，0.1％3,3-二氨基联苯胺，0.1％细胞色素C，0.02％过氧化氢酶，调pH为7.4，并用滤纸过滤。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的幼鱼收集拥有遗传操作品系产的4-20天斑马鱼幼鱼，或收集药物环境因素处理后4-20天的野生型斑马鱼幼鱼，幼鱼前5天不需要进食喂养，5天后幼鱼需要喂食草履虫。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)COX染色前预处理具体步骤如下：

(1)将幼鱼放入带有筛网的六孔板中，后续操作幼鱼皆在筛网中进行，用0.02％MS-222麻醉剂麻醉处理；

(2)筛网转到含10％甲醛溶液中，固定10-15min；

(3)转到含有0.1％TritonX-100的1×PBS中洗三次，每次5min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)的染色需要在28℃培养箱内避光孵育，因为斑马鱼的生存环境为28℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)COX染色后清洗预处理具体步骤如下：

(1)染色结束后，筛网置于1×PBS溶液中清洗三次，每次5min。

(2)筛网转到10％甲醛溶液中固定30min，结束后重复步骤(1)一次；

(3)筛网转到50％甘油溶液中放置30min，再转到100％甘油溶液中长久保存；

(4)根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)的拍照需要用体式显微镜且应在相同光强、放大倍数等参数一致的情况下进行拍照。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)组织冰冻切片需要将COX染色的幼鱼进行OCT包埋，再切片拍照观察，具体步骤如下：

(1)将COX染色的幼鱼放入加有OCT包埋剂的膜具中，摆好形态，放入液氮中，速冻；

(2)将含幼鱼的OCT块放入冷冻切片机中，以8μm的厚度进行切片并黏附于载玻片上；

(3)将有样的载玻片置于1×PBS溶液中清洗三次，每次5min；

(4)在载玻片中滴入50％甘油封片剂，进行封片；

(5)显微镜拍照观察组织细微形态的COX活力情况。