[发明专利]一种基于高通量测序对TCR β进行定量的方法

权利要求书

1.一种基于高通量测序对TCR β进行定量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)使用Trizol裂解样本，在裂解样本中加入固定数目的外参细胞裂解液；

(2)提取样本和外参细胞的总RNA；

(3)利用TCR β的C端特异性引物进行反转录；

(4)在反转录产物中加入固定数目的模板；

(5)使用一组优化了序列组成和使用浓度的多重PCR引物构建TCR β的高通量测序文库；

(6)使用高通量测序平台进行测序；

(7)利用2轮外参数据对样本中的TCR β进行定量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述外参细胞为TCR序列与样本中TCR序列不同的细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述外参细胞为2B4杂交瘤细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，总RNA提取的方法为Trizol法。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，TCR β的C端特异性引物为TRBC，其序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤(3)中，利用TCR β的C端特异性引物进行反转录的步骤如下：

①取0.1ug步骤(2)的RNA、1ul引物TRBC(10uM)、其余为水，配制成12ul的反应体系，然后于PCR仪中72℃孵育3min，迅速冰上5min；

②将步骤①所得产物、4ul 5X first strand buffer、2ul dNTPs、1ul RNA酶抑制剂、1ul RevertAid逆转录酶，配制成20ul的反应体系，然后于PCR仪中42℃孵育60min，70℃孵育10min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述模板有23条，序列如SEQID NO.26-48所示；

和/或，步骤(5)中，所述多重PCR引物的序列如SEQ ID NO.3-25所示，，SEQ ID NO.3-25序列添有高通量测序接头，反向序列如SEQ ID NO.2所示。

和/或，步骤(5)中，多重PCR反应体系共50ul，包括以下反应组分：25ul mPCR预混液、5ul正向引物(FW-primer mix)、5ul反向引物(RW-primer)、1ul Template mix、5ul eDNA、9ul水。

其中正向引物(FW-primer mix)由如SEQ ID NO.3-25所示的序列组成，SEQ ID NO.3-25所示的序列的比例依次为1∶2∶6∶6∶2∶2∶6∶2∶6∶6∶1∶2∶2∶6∶6∶6∶6∶1∶1∶2∶1∶2∶2。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)中，使用的高通量测序平台为IonPGM平台；

步骤(7)中，定量方法包括如下步骤：

(a)利用加入的模板序列分析扩增偏倚规律；

(b)校正碱基突变偏倚引起的序列错误；

(c)利用外参细胞对样本测序数据进行标准化；

(d)对样本中的TCR β进行精确定量。