[发明专利]一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用

说明书

本发明涉及一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用，该方法包括分离、纯化。本发明成功建立树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法，确定了寨卡病毒（Zika virus，Zikv）对树鼩睾丸间质细胞的易感性和病毒增殖特性，为Zikv入侵生殖系统机制研究提供基础。

技术领域

本发明涉及细胞培养及应用领域，尤其是一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用。

背景技术

寨卡病毒（Zika virus, Zikv）为单股正链RNA病毒,主要通过病毒感染的伊蚊类蚊媒叮咬传播,寨卡病毒能够靶向感染神经前体细胞，抑制神经干细胞增殖并引起其分化异常，并最终导致大脑皮层变薄、脑腔体积变大，出现小头症表现。此外，研究表明将寨卡病毒感染可导致小鼠睾丸发生炎症。严重时会引起睾丸内部结构受损及细胞大量死亡，对男性生殖健康带来潜在威胁，但其相关感染机制尚不明确。

睾丸间质细胞（Leydig cells，LCs）主要分布于生精小管之间，是睾丸主要细胞类型之一。LCs在毒理学、药理学及生殖遗传学等研究方面具有十分重要的应用意义，其功能主要是分泌睾酮，是睾丸中唯一能够分泌睾酮的细胞，可促进精子的发生和男性生殖器官发育，以及维持第二性征和性功能，大约95%的雄激素由其分泌，在生殖上具有不可替代的作用，研究发现LCs数量缺少会导致雄性激素缺乏，从而引起生殖上的问题，体外分离培养纯度高、活性强的LCs可更好的研究其相关机制和特性。

目前对LCs分离培养主要集中在大小鼠、牛羊等哺乳动物上，但对于新型实验动物树鼩的LCs分离培养鲜有报道。树鼩（Tree shrew，tupaia belangeri）在生理、生化、新陈代谢、解剖结构以及基因组等生物学特性比啮齿类更接近于非人灵长类，且由于体型小、繁殖快等特点，且对许多人类病毒易感而导致疾病，已广泛应用于人类疾病模型的研究，包括病毒感染模型、肿瘤模型、呼吸系统疾病模型和神经系统疾病模型等。

睾丸中主要有生精细胞、支持细胞和间质细胞等，其中LCs占睾丸细胞的2%~4%，数量较少且纯化难度较大，因此找到一种合适的分离纯化方法至关重要。目前对于睾丸间质细胞的分离培养主要有机械分离法、组织块贴壁法、酶消化法、percoll密度梯度离心法等几种方法，机械分离法对细胞损伤较大，组织块贴壁法杂细胞太多且周期较长，percoll密度梯度离心法得到的细胞仍存在其他杂细胞，还需要添加各种营养成分和生长因子。

如何提高分离效率，通过Zikv对LCs的感染特性研究，建立Zikv感染的睾丸细胞模型，为研究Zikv感染雄性生殖系统的相关研究提供实验基础，是值得研究的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用。

本发明是在对其他动物LCs培养与纯化方法的基础上，采用酶消化、percoll密度梯度离心及差异贴壁等分离纯化方式结合，建立树鼩LCs原代培养和纯化的高效、简单方法，为利用树鼩开展相关研究提供新的实验材料；通过Zikv对LCs的感染特性研究，建立Zikv感染的睾丸细胞模型，为研究Zikv感染雄性生殖系统的相关研究提供实验基础。

本发明的技术方案具体如下：

一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法，按以下步骤进行：

步骤一：分离；

取出睾丸实质组织，清洗后将其剪碎后转入离心管内；加入1mg/mLIV胶原酶，放入CO₂培养箱孵育30~35min，离心，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞；收集到离心管中，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养液重悬细胞，重复离心一次；

步骤二：纯化；