[发明专利]一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用

权利要求书

1.一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于：按以下步骤进行：

步骤一：分离；

取出睾丸实质组织，清洗后将其剪碎后转入离心管内；加入1mg/mLIV胶原酶，放入CO₂培养箱孵育30~35min，离心，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞；收集到离心管中，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养液重悬细胞，重复离心一次；

步骤二：纯化；

采用percoll密度梯度离心法：将分离得到的细胞悬液加于不同密度梯度的Percoll分离液上，从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min离心30min；

收集37%和60%之间的细胞，后用DMEM/F12培养液稀释，再将悬液以1500r/min离心10min，沉淀加入含胎牛血清的培养液，摇匀得细胞悬液；将分离纯化得到的细胞悬液计数，后稀释成1×10⁶个/m L浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中CO₂培养箱中培养，培养基配方为DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青-链霉素；

此时细胞中还含有少量支持细胞和其他杂细胞，根据间质细胞和支持细胞贴壁时间不同，在传代后6h更换培养液以去除杂细胞达到纯化目的，第2代和第3代的细胞仍按此步骤进一步纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：分离之前还进行以下操作：

取3月龄的雄性树鼩，腹腔注射0.4ml 3%戊巴比妥钠麻醉处死后，无菌取出睾丸，75%乙醇中浸泡20 s，取出后用PBS冲洗两遍去乙醇；移入Heraguard ECO 超净工作台，去除睾丸的白膜、附睾及血管，小心取出睾丸实质组织，置于装有预冷D-Hanks液的无菌培养皿中，洗涤2遍，去除血迹。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在percoll密度梯度离心纯化的基础上，根据支持细胞和睾丸间质细胞的贴壁速度不同，通过差异贴壁的方法，在原代细胞贴壁6~12h换液，此方法操作至第3代可得到纯度高达98%的睾丸间质细胞，并能够快速增殖，具备基础的睾酮分泌能力。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一中，加入1mg/mLIV胶原酶，放入37℃、5% CO₂培养箱孵育30~35min，1000r/min离心5min，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入40目细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞；收集到15mL离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤二中，从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min离心30min；收集37%和60%之间的细胞，后用DMEM/F12培养液稀释，再将悬液以1500r/min离心10min，沉淀加入含胎牛血清的培养液，摇匀得细胞悬液；将分离纯化得到的细胞悬液计数，后稀释成1×106个/m L浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中37℃，5% CO2培养箱中培养，培养基配方为DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青-链霉素。

6.权利要求1-5任一项所述的方法制备的物质在制备治疗Zikv感染导致的雄性睾丸损伤及不育的药物中的应用。

7.一种治疗Zikv感染导致的雄性睾丸损伤及不育的药物，其特征在于：包括权利要求1-5任一项所述的方法制备的物质。