[发明专利]检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、试剂盒和iiPCR方法

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，公开了检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、试剂盒和iiPCR方法；其中，所述引物分为上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述试剂盒包括所述引物和探针。本发明试剂盒检测时间短，反应时间仅42分钟，且特异性强、灵敏度高、便于储存，配合恒温隔绝式PCR仪使用，能够满足现场和野外环境下对非洲猪瘟病毒的快速检测需要，具有重要的临床使用价值，可以在基层广泛推广。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、试剂盒和iiPCR方法。

背景技术

非洲猪瘟病毒(ASFV)是非洲猪瘟相关病毒科的唯一成员，临床上以急性、热性、出血性、高发病率和高死亡率为特征，该病毒所引发的非洲猪瘟疫情已扩散至世界各国，对疫情发生国养猪业造成了严重的打击。由于ASF的临床症状很难与古典猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)区分开，且目前还没有成熟有效的ASF疫苗或治愈方案，所以快速诊断、及时扑杀成为了控制疫情的主要措施。

临床检测非洲猪瘟病毒主要依靠普通PCR、实时荧光PCR等实验室诊断方法，但现有检测方法存在耗时长、敏感度低、检测步骤繁琐、设备要求高等技术缺陷。

发明内容

为了解决上述技术缺陷的问题，本发明提出检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、试剂盒和iiPCR方法，该方法检测时间短、特异性强、灵敏度高、便于储存，还具有简便、快速和实用的特点，能够满足现场和野外环境下对非洲猪瘟病毒的快速检测需要。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明第一方面是提供一种检测非洲猪瘟病毒的引物和探针，包括检测非洲猪瘟病毒的引物、探针；

所述引物分为上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，探针的核苷酸序列的5'端连接有荧光基团，3'端连接有非荧光淬灭基团和淬灭基团；

所述荧光基团选自FAM、TET、HEX、CY3、JOE中的一种，进一步为FAM；

淬灭基团选自MGB、BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、Eclipse中的一种，进一步为MGB。

本发明第二方面是提供一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括上述引物和探针。

进一步地，所述试剂盒还包括反应缓冲液、Taq酶、反转录酶、阳性对照品和阴性对照品、dNTPs；

dNTPs由四种核苷酸组成，为dATP、dGTP、dCTP和dUTP。

进一步地，反应缓冲液由以下组分构成：500mMKCl、100mMTris-HCl、15mM MgCl₂，加ddH₂O至体积总量为3ml，pH 8.0～8.5。

进一步地，Taq酶的终浓度为5U·μL^-1，反转录酶的终浓度为20U·μL^-1。

进一步地，阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒DNA片段的样品；

阳性对照品通过以下方法制备得到：将含有非洲猪瘟病毒DNA片段的DNA 样品100μL装入PCR管内，降温至-40～-80℃，然后在8～12pa气压下冻干形成干粉状。

进一步地，阴性对照品为无非洲猪瘟病毒DNA片段的样品；