[发明专利]一种产L-赖氨酸的枯草芽孢杆菌重组菌的构建及其应用

说明书

本发明公开了一种产L‑赖氨酸的枯草芽孢杆菌重组菌的构建及其应用，属于基因工程技术领域。本发明应用基因工程方法，对饲料工业上常用的益生菌B.subtilis ACCC11025进行了系统的代谢工程改造。本发明发现，以来源C.glutamicum中lysC³¹¹、zwf²⁴³和gnd³⁶¹替换B.subtilis中thrD、zwf和gnd(即：重组菌B.subtilis XH4)，有利于L‑赖氨酸的合成，L‑赖氨酸产量达到20.3±1.9g/L。此外，将B.subtilis中hom替换成来源C.glutamicum中hom⁵⁹(即：重组菌B.subtilis XH5)，可实现显著降低副产物产量，L‑赖氨酸产量达到23.2±1.7g/L，且不影响菌体生长。在重组菌B.subtilis XH5中引入C.glutamicum中DapDH会改变二氨基庚二酸途径碳分布而促进L‑赖氨酸的合成，目标重组菌XH6中L‑赖氨酸产量达到25.6±2.3g/L。

技术领域

本发明涉及一种产L-赖氨酸的枯草芽孢杆菌重组菌的构建及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-赖氨酸是动物和人类无法自身合成的氨基酸，属于八大必需氨基酸之一。由于在谷类在加工过程中赖氨酸很容易被破坏，L-赖氨酸得率极低，故L-赖氨酸称为第一限制性氨基酸。因此，L-赖氨酸广泛应用在动物饲料中，具有平衡饲料中氨基酸组成，提高动物贵氨基酸的摄取和代谢，促进包括家畜、家禽和鱼类等在内的生长发育，进而提高饲料蛋白质的利用率，节约生产成本，减少环境污染。全球L-赖氨酸市场目前估计为每年220万吨，并以每年10％左右的速度增长，在世界范围内年产量是继L-谷氨酸后的第二位氨基酸。目前，工业上用于发酵生产L-赖氨酸的菌种主要有大肠杆菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。然而，E.coli和C.glutamicum直接应用于动物饲料中存在一些缺陷，如：存在内毒素、适口性差等。自2013年，国家规定的饲料添加剂目录里已明文规定饲料级L-赖氨酸中不得含有E.coli，而作为市场上饲用级L-赖氨酸产品规格主要是纯度为65％和70％。因此，我们急需开发食品安全性的微生物底盘细胞用于发酵生产饲用L-赖氨酸。

益生菌因其绿色、无残留、无污染的特性成为替代抗生素的最佳选择之一，受到国内外学者和饲料生产企业的广泛关注。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，已被美国食品和药品管理局(FDA)、美国饲料监察协会(AAFCO)和我国农业部认定为饲料安全性菌株，广泛用于饲料中。B.subtilis产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显抑制作用。同时，B.subtilis能合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酶等，可降解饲料中复杂碳水化合物，提高饲料消化率，提高动物生产性能。此外，B.subtilis能刺激动物免疫器官的生长发育，激活T和B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。有研究表明，B.subtilis可使生猪日增重提高6％～7％，饲料转化率提高3％～4％，也能提高肉鸡的抗氧化能力，从而提高肉鸡生长性能。此外，为了有效提高饲料中营养物质的利用率，通过紫外诱变或其他代谢改造B.subtilis选育高产消化性酶类的突变菌株已成为B.subtilis发酵饲料发展趋势。然而，虽然B.subtilis作为益生菌广泛用于饲料中，但是该菌株不能有效积累L-赖氨酸。因此，饲料生产工业上为了同时满足家畜或家禽对L-赖氨酸和B.subtilis的需求，需要同时添加上述两种物质，从而将饲料生产工艺复杂化。此外，L-赖氨酸和B.subtilis的添加在一定程度上增加了企业生产成本。因此，实现B.subtilis高效合成L-赖氨酸有利于简化饲料生产工艺，降低生产成本，提高企业行业竞争力。