[发明专利]一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用

说明书

本发明涉及细胞基因工程领域，具体公开了一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用。本发明用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA在人ARHGAP11B基因的靶向位点位于人ARHGAP11B基因的6号外显子上。本发明提供的特异性sgRNA能够高效靶向人ARHGAP11B基因，并且基于CRISPR/Cas9系统构建敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的方法，该方法操作简便，敲除效果更加彻底。

技术领域

本发明涉及细胞基因工程领域，尤其是涉及一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用。

背景技术

哺乳动物出现了高度发达的大脑皮层(cerebral cortex)，新发展起来的大脑皮层在调节机能上起着重要作用，虽然皮层下各级脑部及脊髓也有发展，但在机能上已从属于大脑皮层。大脑皮质是调节躯体运动或者说控制躯体运动的最高级中枢，人类的大脑皮层更产生了新的飞跃，有了抽象思维的能力，成为意识活动的物质基础。大脑皮层在记忆、注意力、思考、语言、意识、知觉等方面发挥着至关重要的作用。所以可以说大脑皮层相当于人体的“司令部”。因此，对影响大脑皮层发育因素的研究也成为了生命科学研究的热点。

人类新皮层扩张的某些特定方面被认为涉及人类特异性基因组变化。最近的转录组研究确定，某些先前鉴定的人类特异性基因在神经祖细胞中优先表达，并且已将这些基因牵涉到人类新皮层的扩张中。在这些基因中，与神经元相比在人类bRG中表达最特异性的基因是ARHGAP11B。从黑猩猩谱系中分离出人类谱系后，ARHGAP11B发生了进化，这是ARHGAP11A(编码Rho GTPase活化蛋白的基因)部分基因重复的产物。强迫表达的ARHGAP11B在胚胎小鼠的新皮层导致BP(基底祖细胞)增殖和大小的增加。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)技术是干细胞研究领域的一项重大突破，它回避了历来已久的伦理争议，解决了干细胞移植医学上的免疫排斥问题，使干细胞向临床应用又迈进了一大步。随着iPS技术的不断发展以及技术水平的不断更新，它在生命科学基础研究和医学领域的优势已日趋明显。诱导多能干细胞和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用该平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。

通过CRISPR/Cas9技术建立ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系，观察ARHGAP11B基因缺失对iPSC的影响，有望建立转基因ARHGAP11B的体外模型，以便深入探究ARHGAP11B基因的特异性功能及作用。

目前尚未见构建敲除诱导多能干细胞ARHGAP11B基因的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用。其中，本发明提供的特异性sgRNA能够高效靶向人ARHGAP11B基因，并且基于CRISPR/Cas9系统构建敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的方法，该方法操作简便，敲除效果更加彻底。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供了用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA，所述sgRNA在人ARHGAP11B基因的靶向位点位于人ARHGAP11B基因的6号外显子上；所述sgRNA对应的核苷酸序列为以下情况的至少一种：

a)sgRNA1：

gcgtgtaccagactttatcc；

b)sgRNA2：

ggaaaagataccagccatgt；

c)sgRNA3：