[发明专利]一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用在审
| 申请号： | 202210183615.7 | 申请日： | 2022-02-25 |
| 公开（公告）号： | CN114457080A | 公开（公告）日： | 2022-05-10 |
| 发明（设计）人： | 周小青;刘玉;陈涛;金银戈;郑伟;邹庆剑;唐成程;陈敏;程令印;郑雨龄;郑淑文;郭素琴;徐巨才;陈静;赖良学 | 申请（专利权）人： | 五邑大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/65;C12N15/12;C12R1/91 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 柯梦云 |
| 地址： | 529000*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 arhgap11b 基因 缺失 ipsc 细胞系 构建 方法 应用 | ||
1.用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA，其特征在于，所述sgRNA在人ARHGAP11B基因的靶向位点位于人ARHGAP11B基因的6号外显子上；所述sgRNA对应的核苷酸序列为以下情况的至少一种：
a)sgRNA1：
gcgtgtaccagactttatcc；
b)sgRNA2：
ggaaaagataccagccatgt；
c)sgRNA3：
gactttatcctggaaaagat。
2.一种CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体包括权利要求1所述的用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA。
3.如权利要求2所述的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体由质粒px458-exon6和质粒pCEP4-middle酶切后，带入权利要求1所述的用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA、抗性基因Puro和GFP荧光蛋白基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求2或3所述的CRISPR/Cas9载体。
5.一种基于CRISPR/Cas9系统敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将权利要求2或3所述的CRISPR/Cas9载体转染iPSC，培养，通过嘌呤霉素筛选成功转染的阳性iPSC；
S2、对成功转染的阳性iPSC进行多能性鉴定。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中转染为采用BEX CUY2EDITⅡ转染系统的电转。
7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤S1转染结束后，将iPSC加入到含10％CloneRTM的mTeSRTM1培养基中进行培养。
8.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括对阳性iPSC进行PCR鉴定的步骤，PCR鉴定中的引物如SEQ ID NO:5～6所示。
9.如权利要求5～8任一项所述的构建方法获得的iPSC细胞系。
10.如权利要求9所述的iPSC细胞系在建立ARHGAP11B基因敲除的体外细胞模型中的应用。
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