[发明专利]一种大肠杆菌来源的酯酶、编码基因、重组菌和应用

说明书

本发明属于工程菌及其应用技术领域，具体是涉及到一种大肠杆菌来源的酯酶、编码基因、重组菌和应用，酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本申请将具有能编码特定酯酶的基因插入到质粒中，得到重组菌，以此来催化底物醋酸可的松，使其水解，得到产物，反应条件温和，实现了微生物发酵催化醋酸可的松的21位酯的水解，为甾体类侧链的水解提供了另一种可能，本发明通过调节助溶剂重量及其含量等，转化率最高可达到98％，可以有效的降低成本，提高效益。

技术领域

本发明属于工程菌及其应用技术领域，具体是涉及到一种大肠杆菌来源的酯酶、编码基因、重组菌和应用。

背景技术

酯酶是广泛存在与动植微生物中能催化酯健合成或水解的一大类酶。

醋酸可的松(化学名：17α,21-二羟基孕甾-4-烯-3,11,20-三酮-21-醋酸酯,17α,21-dihydroxypregn-4-ene-3,11,20-trione acetat)是肾上腺皮质激素类药物，是甾体激素类原料药中市场需求最大的品种之一。可用于治疗肾上腺皮质低功能症、类风湿性关节炎、风湿病、红斑狼疮等病的治疗；又为泼尼松醋酸酯及其他甾体的中间体。但醋酸可的松及泼尼松醋酸酯本身不具有活性，须在肝内将11位酮基还原为11位羟基后显药理活性。醋酸可的松作为原料药在后续生产较高药物价值的品种时，如：氢化可的松(专利：CN111518151A)、泼尼松(专利：CN111777654A)，伴随着21位酯的水解问题。

目前工业上，醋酸可的松的水解所用的是化学法，在有机溶剂(二氯甲烷、三氯甲烷等)中加入强碱进行水解，水解完成后需要用酸进行中和，提取出的粗产品再次使用有机溶剂进一步精制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌来源的酯酶、编码基因、重组菌和应用。

本发明的内容包括一种大肠杆菌来源的酯酶，酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供一种编码所述酯酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供一种重组菌，所述重组菌的制备方法，包括如下步骤，将所述的编码基因插入到质粒(质粒优选为pET-28a)中，获得重组质粒；然后将重组质粒转入宿主细胞(优选为BL21(DE3))中，获得重组菌。

本发明提供一种所述重组菌在水解醋酸可的松中的应用。

优选的，所述应用的步骤为，将醋酸可的松、助溶剂、缓冲液和重组菌混合，所述助溶剂为异丙醇、甲醇、乙醇、叔丁醇或DMSO(优选为异丙醇)，所述醋酸可的松和助溶剂的重量体积比大于1g:50ml，进行水解反应(反应温度优选控制在30-40℃)，反应完毕后，处理(处理的方法为，TLC监测底物残留量，取反应样，加入萃取剂三氯甲烷，充分振荡后，离心，吸取下清液)，得到产物。

优选的，重组菌在培养过程中，加入乳糖或IPTG(优选IPTG)进行诱导培养，得到诱导后的重组菌，使用诱导后的重组菌进行水解反应。具体过程一般为，将重组菌以一定的接种量(比如0.1％)接种至培养基中(比如LB培养基)，30-40℃条件下(优选37℃)培养一段时间(一般为12-16h)，以此活化菌株，将活化后的菌液接种(接种量优选为2％)到培养基(优选为含有50μg/ml卡纳的LB培养基)中，30-40℃条件下(优选37℃)培养一段时间(一般为4h)后，添加终浓度为0.01mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂，30℃诱导培养16小时，4℃离心收集菌体，得到诱导后的重组菌。

优选的，缓冲液为磷酸氢二盐-磷酸二氢盐缓冲液，优选为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，缓冲液的浓度优选为0.1M，缓冲液的pH控制在7-8。

优选的，反应过程中，控制pH值为7-8(更优选为7-7.5)，优选使用氢氧化钠溶液(质量浓度为10％)。