[发明专利]一种利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法

说明书

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种对虾肠道内弧菌噬菌体快速分离的方法。具体包括以下步骤：步骤1：对虾肠道匀浆；步骤2：目标弧菌的裂解观察；步骤3：子代噬菌体的获取；步骤4：双层平板获得包含噬菌体粒子的上清液；步骤5：噬菌体的纯化；步骤6：噬菌体的富集；本发明提供的利用对虾肠道高效富集分离弧菌噬菌体的方法能够快速、高效、简单的初步分离弧菌噬菌体，解决了取样少，初步分离噬菌体困难的现象。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及到一种利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法。

背景技术

我国是水产养殖业大国，在世界水产养殖中扮演着不可或缺的角色。随着海水养殖业的迅猛发展，弧菌病呈现传播速度快和多发性等趋势，给我国乃至世界水产养殖业带来了不可估量的经济损失。迄今为止，已报道的致病性弧菌种类达到数十种之多；目前在实际生产中，抗生素和化学药物仍然是防治弧菌病最常见和有效的手段，而传统抗生素和化学药物的长期使用，产生了环境污染、细菌耐药性及食品安全等诸多问题。因此，寻找绿色安全的防治弧菌病的手段迫在眉睫。

噬菌体作为细菌的天敌可快速消杀细菌，且具有自我复制、特异性强、筛选周期短、生产成本低、安全无毒等抗生素无法比拟的优点。噬菌体作为一种新型的抗生素替代策略在水产养殖已有着广泛的应用研究基础，其良好的抑菌效果已引起人们的广泛关注。近年来，噬菌体在水产养殖领域的应用报道越来越多。总体来看，水产领域噬菌体研究呈逐年上升趋势，截止2019年4月有关研究论文己达100余篇。

噬菌体制剂开发的核心是获得用于高效裂解致病菌的噬菌体，然而由于弧菌噬菌体在天然水体中的丰度较低，经多次实验发现，很难通过海水富集的方法得到弧菌噬菌体。因此需要一种快速高效，低成本初步分离弧菌噬菌体的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种快速高效，低成本的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，解决初步分离噬菌体困难的现象。以此为基础，为以后优化分离噬菌体提供新思路。

本发明提供的技术方案如下：

一种利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，包括以下步骤：取对虾肠道，加入氯仿后研磨匀浆，加入海水并离心后取上清液并过滤，得到噬菌体初级滤液；将噬菌体初级滤液与所靶向的目标弧菌菌液混合培养，离心取上清液，将上清液过滤，将获取的滤液进行梯度稀释，得到各级稀释滤液；分别将各级稀释滤液与宿主菌混合，并向混合液中加入LB液体培养基，迅速混匀后立刻倾倒在LB固体培养基上，冷却凝固后，倒置培养过夜，得到双层平板；在双层平板中挑取噬菌斑，捣碎后加入缓冲液中，离心获得包含噬菌体粒子的上清液并将噬菌体纯化并富集，得到弧菌噬菌体。

具体的，所述的一种对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，包括以下步骤：

步骤1：对虾肠道匀浆：对虾肠道匀浆：取对虾肠道，加入氯仿后，用研钵研磨匀浆至糊状，往匀浆糊状物中，加入灭菌海水，震荡混匀，离心，取上清液，将上清液过滤，收集噬菌体初级滤液；

步骤2：目标弧菌的裂解观察：将步骤(1)的噬菌体初级滤液与目标弧菌菌液混合培养3～12h，离心，取上清液，将上清液过滤，将获取的滤液进行梯度稀释，得到各级稀释滤液。

步骤3：子代噬菌体的获取：使用LB培养基培养目标弧菌至OD₆₀₀为0.6～1.0，得到宿主菌；分别将步骤(2)的各级稀释滤液与宿主弧菌混合，之后向混合液中加入一定温度的含琼脂的LB液体培养基中，迅速混匀，立即倾倒在LB固体培养基上，冷却凝固后，倒置培养过夜，得到双层平板；

步骤4：离心获得包含噬菌体粒子的上清液:取噬菌斑数量为50～500PFU的双层平板，根据噬菌斑的大小，挑取数个不同形态的噬菌斑，捣碎加入SM缓冲液中，离心获取含有噬菌体粒子的上清液。

步骤5：噬菌体的纯化：用SM缓冲液对噬菌体液进行倍比稀释，取适宜梯度加