[发明专利]穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法

权利要求书

1.穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：将穿心莲总提液与环氧合酶-2、白细胞介素-6和血管紧张素转化酶2混匀后进行孵育，通过超滤膜洗脱，再加入有机溶剂释放生物活性分子后超速离心，收集滤液得到配体溶液，冷冻干燥后加入溶剂进行仪器分析鉴定筛选得到穿心莲中抗炎和抗病毒的多靶标活性配体。

2.根据权利要求1所述的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：包括以下步骤：(1)配制酶促缓冲溶液；

(2)配制穿心莲样品溶液；

(3)穿心莲样品溶液与多靶标酶亲和反应筛选活性成分。

3.根据权利要求2所述的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：所述步骤(1)中，分别量取77.4mL、22.6mL浓度均为1mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，使用去离子水溶解至总体积为1L，充分混合后得到pH值7.4浓度0.1mol/L的磷酸钠酶促缓冲溶液。

4.根据权利要求2所述的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：所述步骤(2)中，称取穿心莲药材100g，采用12倍量85％乙醇回流提取2次，每次2h，提取液合并，过滤后减压浓缩，冷冻干燥得到总提物，再称取适量总提物，使用酶促缓冲溶液充分溶解，得20mg/mL的穿心莲样品溶液；

5.根据权利要求2所述的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：所述步骤(3)中，取适量穿心莲样品溶液和环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2充分混匀后置于37℃恒温振荡培养箱中孵育，孵育后的混合液通过超滤膜洗脱分离，向截留配体的超滤管中加入溶剂室温下静置，离心分离得到滤液，将滤液冷冻干燥后加入溶剂溶解得到与环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2结合的活性成分溶液，将所述活性成分溶液进行色谱-质谱仪器分析鉴定，筛选得到穿心莲中抗炎和抗病毒活性成分；另取等量失活的环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2与穿心莲样品溶液进行相同步骤的对照组实验。

6.根据权利要求2所述的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：所述步骤(3)中，将100μL穿心莲样品溶液和10μL 5U的环氧合酶-2、20μL1μg的白细胞介素-6、20μL1μg的血管紧张素转化酶2充分混匀后置于37℃恒温振荡培养箱中孵育60～90min；将混合液通过截留分子量为10KD或30KD的超滤膜，将穿心莲中与环氧合酶-2、白细胞介素-6、血管紧张素转化酶2结合的配体、未结合的配体进行分离；经10000～12000rpm下高速离心10～15min后，再向超滤管中加入200～300μL所述酶促缓冲溶液，在10000～12000rpm下高速离心3～4次，每次10～15min洗脱未结合的配体；然后向超滤管里加入200～300μL体积比为9:1的甲醇-水混合溶液或乙腈-水混合溶液，室温静置10～15min后在10000～12000rpm下高速离心3～4次，每次10～15min释放与环氧合酶-2、白细胞介素-6或血管紧张素转化酶2结合的配体；收集3～4次离心后的滤液，再经冷冻干燥后加入50～100μL纯乙腈或纯甲醇溶液溶解；采用高效液相色谱-质谱对从穿心莲筛选得到的潜在活性成分进行分析、鉴定；另外，取等量的环氧合酶-2、白细胞介素-6或血管紧张素转化酶2置于100℃沸水中加热，失活后与穿心莲样品溶液进行相同步骤的对照组实验。

7.根据权利要求1～6任一项所述的穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分筛选方法，其特征是：穿心莲抗炎和抗病毒的活性成分为芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸、5-羟基-7,8,2'-三甲氧基黄酮苷、黄芩黄酮I-2'-O-葡萄糖苷、穿心莲内酯、14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯苷、6,4'-二甲氧基异黄酮苷、穿心莲黄酮苷D和14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯。