[发明专利]一种枯草芽孢杆菌全长cDNA文库构建方法及其定向筛选应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌全长cDNA文库构建方法及其定向筛选应用，属于基因工程技术领域。枯草芽孢杆菌B.subtilis是工业中常用的外源蛋白生产菌株，通过构建cDNA文库是筛选枯草芽孢杆菌功能基因的有效方法，本发明将外源蛋白基因与B.subtilis 168cDNA文库共表达，以pAD123质粒为模板，通过同源重组的方法替换麦芽糖诱导型启动子P_glv，该pAD123‑P_glv质粒用于表达B.subtilis全长cDNA。外源蛋白基因由pUB110质粒表达。本发明为原核生物cDNA文库的构建提供技术参考，同时为B.subtilis功能基因的筛选鉴定提供了基础。

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌全长cDNA文库构建方法及其定向筛选应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

cDNA文库是特定物种或组织某一时期所有转录物信息的集合，以这些转录物为模板反转录合成的cDNA经过与特定的载体连接可以获得含有这些转录物信息的克隆集合。这些集合可以凭借二代测序技术用于转录组测序，RNA结构探查，mRNA剪接位点寻址等，或是转化受体菌用于功能基因的鉴定或蛋白互作分析。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属(Bacillus Cohn)的一种革兰氏阳性菌株。B.subtilis由于不产毒素和致热致敏蛋白，因此被列为美国FDA《GRAS(公认为安全物质)》清单认证菌株，其易于分离培养，可高密度发酵和蛋白分泌能力强的特性，使得枯草芽孢杆菌作为重要的工业菌株，用于生产多种外源重组蛋白和代谢产物，其优秀性状具备较高的鉴定价值。但是由于枯草芽孢杆菌等原核生物mRNA结构缺乏类似真核生物的PolyA尾，导致通过Oligo dT引物起始的反转录反应无法进行，而原核生物cDNA文库构建中常用的随机引物方法则无法有效获得全长cDNA。由于对于枯草芽孢杆菌cDNA文库构建方法的描述较少，现有的枯草芽孢杆菌cDNA文库构建研究仅在Karnik P,Gopalakrishna Y,Sarkar N.Construction of a cDNA library from polyadenylated RNA of Bacillussubtilis and the determination of some 3′-terminal sequences[J].Gene,1986,49(1):161-165.和Gopalakrishna Y,Sarkar N.The synthesis of DNA complementary topolyadenylate-containing RNA from Bacillus subtilis.[J].Journal of BiologicalChemistry,1982,257(6):2747-50.中被描述。这些研究均以枯草芽孢杆菌总RNA中的PolyA⁺mRNA为模板通过oligo dT引物介导反转录反应，然而，Poly A⁺mRNA仅占总mRNA的约40％，这大大限制了转录本的丰富性，导致无法生成具有代表性的cDNA文库。因此，通过构建原核生物cDNA文库鉴定其功能基因存在一定限制，其高质量cDNA文库的构建未见报道。

发明内容

本发明提供了一种B.subtilis全长cDNA文库构建方法及定向筛选应用，以解决上述技术问题。

本发明的第一个目的是提供一种构建B.subtilis全长cDNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：

S1：提取枯草芽孢杆菌的总RNA，并去除总RNA中的rRNA；

S2：对S1中去除rRNA的总RNA进行体外腺苷酸化并进行纯化获得Poly A⁺RNA；

S3：利用具有末端转移活性的逆转录酶将S2中的Poly A⁺RNA反转录成单链cDNA，并用与逆转录酶末端转移活性生成碱基互补配对的寡合苷酸标记单链cDNA的3’末端；