[发明专利]一种枯草芽孢杆菌全长cDNA文库构建方法及其定向筛选应用

权利要求书

1.一种构建枯草芽孢杆菌全长cDNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：提取枯草芽孢杆菌的总RNA，并去除总RNA中的rRNA；

S2：对S1中去除rRNA的总RNA进行体外腺苷酸化并进行纯化获得PolyA⁺RNA；

S3：利用具有末端转移活性的逆转录酶将S2中的PolyA⁺RNA反转录成单链cDNA，并用与逆转录酶末端转移活性生成碱基互补配对的寡合苷酸标记单链cDNA的3’末端；

S4：将S3中的单链cDNA在PCR引物和锚定引物的引导下合成并扩增cDNA第二条链，纯化富集片段大小≥500bp的双链cDNA；

S5：将S4中的双链cDNA连接到质粒上并转化至大肠杆菌，获得枯草芽孢杆菌全长cDNA文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中采用Poly(A)聚合酶进行体外腺苷酸化反应。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中的反转录的引物的序列如SEQ IDNO.1所示，S4中的PCR引物的序列如SEQ ID NO.2所示，锚定引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S5中所述质粒包括pAD123。

5.一种枯草芽孢杆菌筛选系统，其特征在于，所述筛选系统以枯草芽孢杆菌为宿主，包含携带外源基因的筛选质粒和根据权利要求1～4任一所述方法构建的B.subtilis全长cDNA文库抽提得到的混合质粒。

6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌筛选系统，其特征在于，所述筛选质粒以pUB110为载体。

7.根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌筛选系统，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌SCK6。

8.一种构建枯草芽孢杆菌筛选系统的方法，其特征在于，将根据权利要求1～4任一所述方法构建的的枯草芽孢杆菌全长cDNA文库进行质粒抽提，并转化至含有携带外源基因的筛选质粒的枯草芽孢杆菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述筛选质粒以pUB110为载体。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌SCK6。