[发明专利]一种胞外分泌表达Ulp1蛋白酶的大肠杆菌基因工程菌株及其应用

说明书

本发明涉及蛋白表达技术领域，具体涉及一种胞外分泌表达Ulp1蛋白酶的大肠杆菌基因工程菌株及其应用。本发明提供Ulp1蛋白酶的融合蛋白以及用于表达Ulp1蛋白酶的载体和大肠杆菌工程菌株，该载体和菌株能够实现高效的Ulp1蛋白酶的胞外分泌表达，Ulp1蛋白酶可以在较短时间内大量分泌表达，且无需纯化即具有高效的SUMO标签切割活性。本发明提供的Ulp1蛋白酶的制备方法具有制备工艺简单，快捷高效、成本低等优势，具有较好的应用价值。

技术领域

本发明涉及蛋白表达技术领域，具体涉及一种胞外分泌表达Ulp1蛋白酶的大肠杆菌基因工程菌株及其应用。

背景技术

小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)是类泛素蛋白家族成员，它具有结合赖氨酸侧链来修饰靶蛋白的功能(Sumoylation，SUMO化)。SUMO化是一个可逆的翻译后修饰过程，在真核细胞内发挥着极其重要的作用，如转录、DNA重组、DNA修复、蛋白质转运和细胞周期调控等。SUMO目前被开发作为一种促进重组蛋白可溶性表达的融合标签，被用来表达多种活性蛋白、多肽、细胞因子和抗菌肽等。SUMO标签可以促进重组蛋白质的折叠，增强蛋白质可溶性表达，提高融合蛋白的表达量、生物活性和稳定性。最重要的是，SUMO标签可以被SUMO蛋白酶Ulp1特异性识别并切割，目的蛋白N端没有残余的氨基酸，从而产生具有天然N端的目的蛋白，其空间结构和生物学活性得到很好的保留。传统的蛋白酶如凝血酶、肠激酶、烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)和factor Xa等因其识别特定的氨基酸序列，也常用于融合标签的切除，但是蛋白质复杂的空间构象会严重降低这些蛋白酶的酶切效率，而且切割产生的目的蛋白的N端会残留几个氨基酸，影响目的蛋白活性。与这些传统蛋白酶不同，Ulp1识别的是SUMO的三级结构，可以高效而特异性的切割SUMO标签C端的异肽键，不会发生错误切割，酶切效率极高。

Ulp1蛋白酶来源于酿酒酵母，含有621个氨基酸，其中403-621氨基酸编码保守的Ulp结构域，该结构域具有和全长蛋白一样的酶切活性。Ulp1通常在大肠杆菌胞内表达，内源杂蛋白较多，需要通过亲和层析、离子交换和分子筛等多个步骤纯化制备而成，纯化过程繁琐复杂。由于胞内内源蛋白酶的存在，Ulp1也会发生一定的降解，影响产量；而且在大肠杆菌菌体破碎之后，大量的LPS会混在蛋白样品中，较难去除，进一步增加了纯化成本。若能将Ulp1分泌表达至大肠杆菌培养基上清液中则可以有效地规避上述问题。在枯草芽孢杆菌和毕赤酵母中虽然已有分泌表达Ulp1的报道，但是还存在着分泌表达产量低、生长速度慢和培养基价格昂贵等诸多缺点。因此，提供一种高表达量、低成本、分离纯化方法简便的高效制备Ulp1蛋白酶的方法具有重要意义。

通过同源重组手段对细胞膜组分相关基因进行敲除，可以显著提高大肠杆菌细胞膜的通透性，促进外源重组蛋白胞外分泌表达。肽聚糖相关的外膜脂蛋白pal基因在维持大肠杆菌细胞外膜的稳定性上发挥着重要作用，pal基因的缺失可能会使大肠杆菌细胞外膜变的松散，有利于周质空间中的蛋白渗漏到胞外，实现胞外生产外源重组蛋白。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种Ulp1蛋白酶的融合蛋白。

本发明的第二目的是提供用于表达Ulp1蛋白酶的载体以及大肠杆菌基因工程菌株。

本发明的第三目的是提供利用上述载体、菌株制备Ulp1蛋白酶的方法。

为解决目前Ulp1蛋白酶表达和制备存在的问题，本发明提供一种可实现胞外分泌表达的Ulp1蛋白酶的融合蛋白和大肠杆菌基因工程菌株。利用该菌株表达Ulp1蛋白酶的融合蛋白，Ulp1蛋白酶可直接分泌至胞外培养基中，降低Ulp1蛋白酶在胞内的降解，提高Ulp1蛋白酶的表达量；同时降低Ulp1蛋白酶在胞内的过度积累，减少包涵体的形成；无需破碎大肠杆菌菌体即可获得Ulp1蛋白酶，降低内毒素的污染，简化Ulp1蛋白酶分离纯化步骤，显著降低生产成本。

具体地，本发明提供以下技术方案：