[发明专利]一种通过不连续分化制备肾脏足细胞的方法

说明书

本发明公开了一种通过不连续分化制备肾脏足细胞的方法，利用不连续的方法将诱导多能干细胞分化成肾脏足细胞。本发明的方法能够先将多能干细胞定向诱导分化得到肾祖细胞，鉴定分化程度高的肾祖细胞并对其进行冻存，大规模制备后再复苏后定向诱导分化为足细胞，本发明方法，所得的足细胞分化效率高、一致性高和存活率高。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种通过不连续分化制备肾脏足细胞的方法。

背景技术

足细胞是终末分化的肾脏固有上皮细胞，不具备增殖能力，其体外培养具有一定难度。最初人们使用其他肾脏细胞系研究足细胞病的发病机制，20世纪70年代左右才建立起从体内分离肾小球得到原代足细胞的方法，使人们能够直接对足细胞进行研究。由于原代细胞不能再增殖和传代，因此每次原代培养得到的细胞有限，使原代足细胞的应用受限。鉴于原代细胞的这些限制，人们通过永生化技术建立了足细胞系。虽然足细胞系克服了原代培养每次得到的足细胞数量有限的问题，永生化的足细胞系足细胞标志蛋白的表达不稳定，即使是同种属的足细胞系的表型也有较大的差异。因此得到表型稳定的足细胞对理解和治疗肾脏疾病有着积极的意义和重要的作用。

随着对肾脏发育的研究进展，研究人员已经可以将干细胞分化成类肾体细胞或者肾脏细胞，一般来说通过WNT激动剂将干细胞诱导分化至原条期，再诱导分化至中胚层阶段，最后通过分化培养基诱导分化出肾脏类器官。也有相关技术使用多种诱导因子和培养基将多能干细胞分化为足细胞，使细胞命运发生剧烈变化，科研人员和实验室需要投入较多精力与经费进行摸索才能诱导成功。同时，不同批次之间分化的足细胞差异较大，因此，有必要改进从干细胞诱导分化得到足细胞的方法。现有技术(CN110662832A)由间介中胚层细胞分化诱导肾祖细胞(NPC)的方法和由多能干细胞分化诱导肾祖细胞的方法公开了诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法，上述专利的方法需要用到的生物试剂繁多，每天都要更换不同成分的培养基培养细胞，整个阶段基本都要用到CHIR(GSK-3β抑制剂)，而且由多能干细胞到肾祖细胞耗时长，约11天。现有技术(Yoshimura Y,et al.Manipulation ofNephron-Patterning Signals Enables Selective Induction of Podocytes fromHuman Pluripotent Stem Cells[J].Journal of the American Society ofNephrology,2019,30(2):ASN.2018070747.)公开了诱导肾祖细胞分化为足细胞的方法，该方法需要用到的生物试剂繁多，需要6～8天。从上述现有技术可知从多能干细胞分化到足细胞，整个周期长达17～20天。虽有现有技术公开多能干细胞分化成足细胞的方法相对比较简单，耗时也相对短(13天)，但这些分化方案没有办法得到分化过程中的中间细胞肾祖细胞，其是一个连续分化的过程，因此对实验操作和细胞形态鉴定要求较高。

发明内容

本发明旨在简化从多能干细胞诱导分化为肾脏足细胞的过程。为此，本发明提出一种足细胞的制备(诱导分化)方法。该制备方法简单，而且该方法既可以从多能干细胞一步到位连续分化成为足细胞，也可以分两步实施，第一步稳定诱导分化得到肾祖细胞，可将肾祖细胞并对其进行冻存后待用，第二步肾祖细胞定向诱导为足细胞，将连续诱导分化得到足细胞的过程拆分为两个不连续的过程。

本发明的目的是提供一种从多能干细胞制备足细胞的方法。

本发明的目的是提供一种从多能干细胞制备肾祖细胞的方法。

本发明的另一目的是提供一种从肾祖细胞制备足细胞的方法。

本发明的另一目的是提供一种从多能干细胞不连续分化为足细胞的方法。

本发明的另一目的是提供一种足细胞。

本发明的另一目的是提供一种培养基。

本发明通过以下技术方案实施：

一种从多能干细胞制备足细胞的方法，包括如下步骤：