[发明专利]一种通过不连续分化制备肾脏足细胞的方法

权利要求书

1.一种从多能干细胞制备足细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1：利用含有GSK-3α/β 抑制剂的Advanced RPMI-1640培养基培养人诱导多能干细胞至中间中胚层阶段；培养时间为65~96小时；所述的GSK-3α/β抑制剂为CHIR99027，所述CHIR99027的工作浓度为1~10μM；

S2：利用含有FGF9、BMP7和维生素A的Advanced RPMI-1640培养基诱导步骤S1所得细胞分化为肾祖细胞；诱导分化的培养时间为42~72小时；所述的FGF9的工作浓度为50~500ng/mL，所述BMP7的工作浓度为50 ~500ng/mL，所述维生素A的工作浓度为50~200nM；

S3：将肾祖细胞转移至胶原包被的培养器中，利用含有胎牛血清、Glutamax-1、维生素D3和维生素A的DMEM/F12培养基诱导步骤S2所得肾祖细胞分化为足细胞；诱导分化的培养时间至少为192小时；所述的胎牛血清体积分数为5%~30%，所述Glutamax-1体积分数为0.1%~10%，所述维生素D3的工作浓度为50~200nM，所述维生素A的工作浓度为50~200nM；

S1~S3中，细胞培养基换液频率为每24小时内一次。

2.根据权利要求1所述的从多能干细胞制备足细胞的方法，其特征在于：

步骤S3所述的诱导步骤S2所得肾祖细胞分化为足细胞，其诱导分化的培养时间为192小时~288小时。

3.根据权利要求1所述的从多能干细胞制备足细胞的方法，其特征在于：在步骤S1所述利用含有GSK-3α/β 抑制剂的培养基培养多能干细胞至中间中胚层阶段前，所述多能干细胞在含ROCK抑制剂的培养基中培养。

4.一种从肾祖细胞制备足细胞的方法，其特征在于：利用含有胎牛血清、Glutamax-1、维生素D3和维生素A的DMEM/F12培养基诱导肾祖细胞分化为足细胞；诱导分化的培养时间至少为192小时；所述的胎牛血清体积分数为5%~30%，所述Glutamax-1体积分数为0.1%~10%，所述维生素D3的工作浓度为50~200nM，所述维生素A的工作浓度为50~200nM；细胞培养基换液频率为每24小时内一次。

5.一种从多能干细胞不连续分化为足细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1：利用含有GSK-3α/β 抑制剂的Advanced RPMI-1640培养基培养人诱导多能干细胞至中间中胚层阶段；培养时间为65~96小时；所述的GSK-3α/β抑制剂为CHIR99027，所述CHIR99027的工作浓度为1~10μM；

S2：利用含有FGF9、BMP7和维生素A的Advanced RPMI-1640培养基诱导步骤S1所得细胞分化为肾祖细胞；诱导分化的培养时间为42~72小时；所述的FGF9的工作浓度为50~500ng/mL，所述BMP7的工作浓度为50 ~500ng/mL，所述维生素A的工作浓度为50~200nM；

S3：冻存步骤S2所得的肾祖细胞；

S4：复苏步骤S3冻存的肾祖细胞；

S5：将肾祖细胞转移至胶原包被的培养器中，利用含有胎牛血清、Glutamax-1、维生素D3和维生素A的DMEM/F12培养基诱导步骤S4复苏的肾祖细胞分化为足细胞；诱导分化的培养时间至少为192小时；所述的胎牛血清体积分数为5%~30%，所述Glutamax-1体积分数为0.1%~10%，所述维生素D3的工作浓度为50~200nM，所述维生素A的工作浓度为50~200nM；

S1、S2、S5中，细胞培养基换液频率为每24小时内一次。