[发明专利]一种基于无血清培养基的轮状病毒培养方法

说明书

本发明涉及一种基于无血清培养基的轮状病毒培养方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种轮状病毒培养方法，所述方法先使用无血清培养基对宿主细胞进行逐级扩大培养至生物反应器，然后使用添加有无动物源性胰蛋白酶的无血清培养基在生物反应器中对轮状病毒进行培养，所述逐级扩大培养过程中，使用无动物源性胰蛋白酶对上一级扩大培养得到的宿主细胞进行消化，使用无动物源性胰蛋白酶抑制剂对经消化的宿主细胞进行中和，以及，使用无血清培养基对经中和的宿主细胞进行重悬以获得供下一级扩大培养的宿主细胞；所述方法可在保证病毒滴度不降低的情况下省略细胞洗涤的过程，同时排除因血清、猪源胰蛋白酶等引入外源因子的风险。

技术领域

本发明涉及一种基于无血清培养基的轮状病毒培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科，是引起五岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体之一，全球每年感染人数上亿，造成死亡人数数十万。95%以上的儿童在5岁前至少感染过一次轮状病毒。据WHO统计，每年因轮状病毒感染而导致的死亡病例高达60万，而腹泻病例则高达2亿。

轮状病毒在1973年首次被发现，但至今仍无特效药。安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段。轮状病毒疫苗免疫可以显著的降低婴幼儿因轮状病毒感染而造成的重症腹泻的比例。过去，由于传代细胞系和大规模培养技术的使用，轮状病毒疫苗生产技术已取得了令人瞩目的成就。然而，目前的轮状病毒疫苗生产用培养基需添加胎牛血清、猪胰蛋白酶等动物源性成分，存在外源因子（extraneous agents，EA）污染的风险。

外源因子是指生物制品生产过程中存在于菌毒种、细胞基质及生产制品所用的原材料及制品中的污染物，包括细菌、真菌、支原体和病毒，通常外源因子主要指病毒性外源因子（简称外源病毒）。在过去60年中，轮状病毒疫苗生产发生过多起疫苗被污染外源病毒事件，葛兰素史克公司（GSK）的轮状病毒疫苗Rotarix中曾发现猪圆环病毒（PCV）污染，可能是生产过程中使用猪胰酶携带所致。

除猪圆环病毒污染以外，从胎牛血液提取的胎牛血清、从猪胰脏提取的猪胰蛋白酶等动物源性成分还会给轮状病毒疫苗生产带来包括牛病毒性腹泻病毒（BVD）、牛副流感病毒3型（PI3）、牛腺病毒（BAV-3）、牛细小病毒（BPV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）在内的多种外源因子污染风险。因上述部分外源因子具有致病性，污染可能会引起生物安全问题，为了避免外源因子污染的出现，各国药典均规定了需在轮状病毒疫苗生产过程中进行全面的外源因子质控检查。然而，为了尽可能的从根源性的杜绝外源因子污染风险，开发无动物源性成分的轮状病毒疫苗生产工艺势在必行。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种轮状病毒培养方法，所述方法包括如下步骤：

宿主细胞的制备：使用无血清培养基将宿主细胞逐级扩大培养至添加有微载体的生物反应器中至宿主细胞长满微载体后，排出上清，得到待接种的生物反应器；所述逐级扩大培养过程中，使用无动物源性胰蛋白酶对上一级扩大培养得到的宿主细胞进行消化，使用无动物源性胰蛋白酶抑制剂对经消化的宿主细胞进行中和，以及，使用无血清培养基对经中和的宿主细胞进行重悬以获得供下一级扩大培养的宿主细胞；

轮状病毒的培养：将轮状病毒毒株活化并接种至病毒维持液中后，将经接种的病毒维持液添加至待接种的生物反应器中进行病毒培养，得到轮状病毒培养液；所述病毒维持液为添加有无动物源性胰蛋白酶的无血清培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶在无血清培养基中的浓度为1~7µg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶在无血清培养基中的浓度为4µg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述消化为：将宿主细胞于预热至35~38℃的消化液中浸泡30~60s，浸泡结束后，弃去消化液，将宿主细胞于35~38℃下消化5~10min，得到经消化的宿主细胞；所述消化液为添加有无动物源性胰蛋白酶的缓冲液。