[发明专利]一种基于无血清培养基的轮状病毒培养方法

权利要求书

1.一种轮状病毒培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

宿主细胞的制备：使用无血清培养基将宿主细胞逐级扩大培养至添加有微载体的生物反应器中至宿主细胞长满微载体后，排出上清，得到待接种的生物反应器；所述逐级扩大培养过程中，使用无动物源性胰蛋白酶对上一级扩大培养得到的宿主细胞进行消化，使用无动物源性胰蛋白酶抑制剂对经消化的宿主细胞进行中和，以及，使用无血清培养基对经中和的宿主细胞进行重悬以获得供下一级扩大培养的宿主细胞；

轮状病毒的培养：将轮状病毒毒株活化并接种至病毒维持液中后，将经接种的病毒维持液添加至待接种的生物反应器中进行病毒培养，得到轮状病毒培养液；所述病毒维持液为添加有无动物源性胰蛋白酶的无血清培养基；

所述无动物源性胰蛋白酶在无血清培养基中的浓度为1~7µg/mL；

所述中和为：在消化后的宿主细胞中添加中和液至浸没宿主细胞，得到经中和的宿主细胞悬液；所述中和液为添加有无动物源性胰蛋白酶抑制剂的无血清培养基；

所述无动物源性胰蛋白酶抑制剂在无血清培养基中的浓度为0.25~4mg/mL；

所述消化为：将宿主细胞于预热至35~38℃的消化液中浸泡30~60s，浸泡结束后，弃去消化液，将宿主细胞于35~38℃下消化5~10min，得到经消化的宿主细胞；所述消化液为添加有无动物源性胰蛋白酶的缓冲液；

所述无动物源性胰蛋白酶在缓冲液中的浓度为0.2~1.2mg/mL；

所述轮状病毒毒株活化为：在轮状病毒的病毒液中加入无动物源性胰蛋白酶和氯化钙进行病毒活化，得到病毒活化液；

所述无动物源性胰蛋白酶在轮状病毒的病毒液中的浓度为5~15μg/mL。

2.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶在无血清培养基中的浓度为4µg/mL。

3.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶在缓冲液中的浓度为0.8mg/mL。

4.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述缓冲液中还添加有金属离子螯合剂。

5.如权利要求4所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述金属离子螯合剂在缓冲液中的浓度为0.1~0.3g/L。

6.如权利要求5所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述金属离子螯合剂在缓冲液中的浓度为0.2g/L。

7.如权利要求4所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸。

8. 如权利要求4~7任一项所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述缓冲液为浓度0.01~0.05M、pH 7.2~7.6的PBS缓冲液。

9.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶抑制剂在无血清培养基中的浓度为0.5mg/mL。

10.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶在轮状病毒的病毒液中的浓度为10μg/mL。

11.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述氯化钙在轮状病毒的病毒液中的浓度为400~800μg/mL。

12.如权利要求11所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述氯化钙在轮状病毒的病毒液中的浓度为600μg/mL。

13.如权利要求1~3任一项所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶为重组胰蛋白酶。

14.如权利要求1~3任一项所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶抑制剂为大豆胰蛋白酶抑制剂。