[发明专利]一种外周血单个核细胞制备肝脏类器官的方法

权利要求书

1.一种肝祖细胞球的增殖培养基，其特征在于，所述增殖培养基为含有N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、GlutaMAX、乙酰半胱氨酸、N2、B27无血清细胞培养添加剂、烟酰胺、胃泌素、A83-01、Forskolin、R-spondin-1蛋白、Wnt3a蛋白、和表皮细胞生长因子EGF的DMEM/F12基础培养基。

2.一种肝脏类器官的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基为含有牛血清白蛋白、B27细胞培养添加剂、ITS细胞培养添加物、L-ascorbic acid trisodium salt、乙酰半胱氨酸、肝细胞生长因子HGF蛋白、抑瘤素M、地塞米松、表皮细胞生长因子EGF蛋白、EGF、8-溴-环磷酸腺苷、维生素K2、石胆酸、和Y27632的HM基础培养基。

3.权利要求1所述肝祖细胞球的增殖培养基和/或权利要求2所述肝脏类器官的诱导培养基在制备肝脏类器官中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在多能干细胞制备肝脏类器官中的应用。

5.一种多能干细胞细胞制备肝脏类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将多能干细胞诱导分化为末端前肠内胚层细胞；

S2.将末端前肠内胚层细胞在基质胶内重悬，之后用权利要求1所述肝祖细胞球的增殖培养基培养，得到类器官细胞球；

S3.解离并消化上一步的得到的类器官细胞球，用权利要求2所述肝脏类器官的诱导培养基培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述多能干细胞是外周血单个核细胞重编程得到的。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中，将末端前肠内胚层细胞在具有基质胶内重悬，所述基质胶形成的胶滴呈立体形状。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中，末端前肠内胚层细胞在基质胶内重悬的方法包括以下步骤：

S21.将末端前肠内胚层细胞消化处理，固液分离，取细胞沉淀；

S22.Matrigel基质胶与沉淀细胞混合，吹吸充分混合，并避免混入气泡，保持避免基质胶凝固，得到细胞基质胶悬液；

S23.将细胞基质胶悬液加入具有尖底或锥底的容器中，保持在容器的尖底或锥底，孵育至全部基质胶凝固；

S24.吹打尖底或锥底的容器底部的基质胶，转移至后续培养容器中。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中，使用权利要求1所述肝祖细胞球的增殖培养基共培养10～14天；步骤S3中，使用权利要求2所述肝脏类器官的诱导培养基共培养10～14天。

10.权利要求5到9任一所述方法制备得到的肝脏类器官。