[发明专利]多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR-T细胞产品中RCR阴阳性的方法

说明书

本发明公开了一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR‑T细胞产品中RCR阴阳性的方法，其特征在于，包括如下步骤：全血样品抽取DNA，通过合成含有目的基因和内参基因的质粒，用于配制标准曲线和质控样品，并建立多重qPCR反应体系来检测样品中的RCR。特异性强：针对目的基因设计了特异性探针，在特异性评估中验证通过。灵敏度高：反应更灵敏，方法的检测下限能够达到10copies/μL。省时省力：qPCR检测RCR的方法操作简单，更易入手，反应时间只需1小时。

技术领域

本发明涉及生物基因检测领域，具体涉及一种多重qPCR检测GALV和ALB 拷贝数判定CAR-T细胞产品中RCR阴阳性的方法。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)因其在血液肿瘤中的显著疗效已成为肿瘤免疫治疗领域中的国际研究新热点，成为肿瘤治愈新的希望。目前，在CAR-T细胞产品的生产中，通常是利用逆转录病毒载体将CAR基因高效地导入T细胞中，但在使用这些病毒载体的同时也带来了CAR-T产品污染复制型逆转录病毒(RCR)的潜在风险。虽然随着病毒载体设计及生产体系的不断改进，这种风险已大大降低，但仍不能完全排除。因此，监管机构要求对于临床使用的逆转录病毒载体、转导的CAR-T细胞产品以及患者均要进行复制型病毒的检测。

根据国家食品药品监督管理要求，RCR检测推荐采用基于敏感细胞的扩增培养法，但该方法耗时较长，不适用于细胞产品的放行及快速检测。qPCR 是一种灵敏度高、特异性强且可通过实时监控进行定量的核酸检测技术，尤其是荧光探针法，设计序列特异性的Taqman探针，灵敏度高，特异性强，已经被应用于生物制药的一些领域。

发明内容

本发明的目的提供一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR-T细胞产品中RCR阴阳性的方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。

根据本发明所提供的一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR-T细胞产品中RCR阴阳性的方法，其特征在于，包括如下步骤：全血样品抽取DNA，通过合成含有目的基因和内参基因的质粒，用于配制标准曲线和质控样品，并建立多重qPCR反应体系来检测样品中的RCR。

在一些实施方式中，所述qPCR反应体系的配制如下，在20μL反应体系中，加入TaqMan Fast Advanced Master Mix、GALV引物及探针、ALB引物及探针、1μL DNA模板，用去离子水补足至20μL。

在一些实施方式中，所述TaqMan Fast Advanced Master Mix的型号为ABI，4444556。

在一些实施方式中，所述GALV引物包括GALV正向引物和GALV反向引物， GALV正向引物和GALV反向引物的的终浓度为320nM；所述ALB引物包括ALB正向引物和ALB反向引物，所述ALB正向引物和ALB反向引物的终浓度为120nM。

8、在一些实施方式中，合成所述GALV和所述ALB正向引物、反向引物和探针的溶液的制备见表1和表2：

表1.GALV基因的引物探针序列