[发明专利]一种突变型RNase R及其制备方法和应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种突变型RNase R及其制备方法和应用。本发明提供的突变型RNase R被命名为RNase R__△M8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明提供的突变型RNase R_△M8的制备过程包括载体构建、载体转化、蛋白诱导表达、细菌收集、蛋白纯化及活性测定等过程。本发明提供的突变型RNase R，提高了RNase R表达产量及耐盐性，有利于满足多样化的RNA样本要求。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种突变型RNase R及其制备方法和应用。

背景技术

RNase R(Ribonuclease R)的分子量约为91.4kDa，是一种来源于大肠杆菌 RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可从3’-5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环状RNA(circRNA)、套索结构RNA(lariat RNA)、末端为双链的RNA。

目前RNase R常被用于circRNA的富集和鉴定研究。高通量测序是大批量发现circRNA最快捷的方法，但传统的全转录组测序只能发现丰度较高的 circRNA，对丰度稀少的circRNA则无能为力。而在全转录组测序的方法上再增加一步RNase R消化(RNase R+)，则可以使circRNA相对富集，最终使circRNA 的junction reads相对于“RNase R-”样本有5-10倍的富集，大大提升了circRNA 的发现量。另外，随着RNA疫苗的兴起，circRNA也被各大生物医药公司列入为极具研究潜能的RNA疫苗候选分子，RNase R将有望成为circRNA规模化制备及纯化的重要原料之一。此外，RNase R也常被相关领域的研究者用于circRNA 和lariat RNA的鉴定。

RNase R的反应条件一般为37℃，10-30min，且反应体系要求较低的NaCl 浓度。当反应体系中NaCl的浓度100mM时，RNase R的活性会明显受抑制。这种条件的限制对RNA样本纯度提出了更高的要求，同时增加了RNA的制备成本及损失量。

因此急需开发一种耐盐且蛋白表达产量高的RNase R突变体。

发明内容

针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种突变型RNase R及其制备方法和应用。本发明提供的突变型RNase R，提高了RNase R表达产量及耐盐性，有利于满足多样化的RNA样本要求。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种突变型RNase R，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选地，编码所述突变型RNase R氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6 所示。

优选地，所述氨基酸序列为E.coli来源的野生型RNase R的氨基酸序列定点突变所得；所述E.coli来源的野生型RNase R的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，编码所述E.coli来源的野生型RNase R的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

优选地，所述定点突变为将E.coli来源的野生型RNase R的氨基酸序列的 601至608号氨基酸截断突变所得。

本发明还提供了一种所述的突变型RNase R的制备方法，包括如下步骤：

S1、构建含有编码所述突变型RNase R的核苷酸序列的载体；

S2、将步骤S1获得的载体转化至表达菌株BL21大肠杆菌细胞中，获得表达菌株；

S3、将步骤S2获得的表达菌株扩大培养并进行蛋白诱导表达；