[发明专利]一种儿童纤毛不动综合征气管类器官的培养液和培养方法

说明书

本发明提供了一种儿童气管类器官的培养液和培养方法，培养液是含有如下各终浓度的组分的Advanced DMEM/F12培养基：GlutaMax‑I添加剂1×、B27添加剂1×、HEPES缓冲液1×、青霉素‑链霉素双抗溶液1×、烟酰胺3～5mM、N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸1～1.5mM、Y‑27632 4～6μm、SB202190 400～600nm、A83‑01 400～600nm、R‑Spondin1 400～600ng/ml、FGF7 20～30ng/ml、FGF10 90～110ng/ml、Noggin 90～110ng/ml、EGF 1～10ng/ml。本发明方法使用少量的气管上皮组织，即可培养出成形率高、体积大的气管类器官，成功率高，培养周期短，基于培养得到的类器官从基因、蛋白以及结构功能方面系统评估儿童PCD患者气管上皮中纤毛细胞及纤毛摆动状态，可完成对患者纤毛基因、结构及功能的全方位评估，相比于目前需要多次活检取样原位细胞的PCD诊疗手段，极大地降低了有创操作次数，减少了疾病负担。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及类器官培养方法，更具体涉及一种儿童纤毛不动综合征气管类器官的培养液和培养方法。

背景技术

纤毛不动综合症(PCD)是一种罕见的以反复呼吸道感染为主遗传性疾病，目前认为至少有50个基因突变与PCD形成密切相关，病变主要累及上、下呼吸道纤毛细胞的纤毛形成及运动。目前PCD临床指南主要参考欧洲及北美的诊断指南，临床诊断主要依赖nNO生成速率、纤毛高速运动分析、基因检测和电镜辅助诊断，但是PCD诊断尚无金标准，同时尚不存在单一的诊断手段可以用于确诊或排除PCD。

而在上述主要的诊断手段中，纤毛高速运动分析和电镜辅助诊断依赖于纤维支气管镜活检术，用纤维支气管镜捕捉患者气管纤毛细胞，随机性较大，可能未取得纤毛细胞或者细胞样本较少，需要多次行纤维支气管镜活检术，对患者造成多次伤害；而且，PCD表型存在多型性，根据目前的诊断标准，纤毛高速运动分析和电镜检测均需要多次送检方能确诊或排除PCD，如果利用原位细胞作为样本送检，同样需要多次进行纤维支气管镜活检术，对患者造成多次伤害；而若采用常规的细胞二维培养、冻存以供送检，则在培养过程中容易产生基因型及表型的改变，无法稳定传代和保存，影响送检结果。

类器官属于三维(3D)细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。类器官的培养多是使用人成体干细胞在体外进行系统性培养，模拟体内生长环境，保留器官记忆，实现细胞体外自我组织，重现器官结构。体外培养的3D类器官结构包含多种分化成熟的细胞并能维持对应的紧密结构，发挥响应细胞的功能，在结合特定的干预因素下，模拟器官生理及病理状态；目前肺、小肠、肝、胆、胰、前列腺、乳腺、食管等结构的类器官及肿瘤类器官均已成功构建，广泛应用于器官研究、药物研发及患者个性化治疗，因此，若能构建PCD患者的气管类器官，以类器官作为样本进行检测和诊断，将大大降低对患者的伤害，并且提高检测诊断准确性。

然而，目前气管类器官的培养仍然面临着问题：支气管镜活检取样的细胞数量有限，培养成功率低，周期较长，成本较高；因此目前气管类器官培养的原代主要采用肺叶组织，难以准确反映气管部位病变(例如PCD)。进一步地，尤其对于儿童而言，无论是对气管还是肺叶组织进行活检取样都更为困难，样本量非常少，导致类器官培养的成功率很低。同时，不同的组织培养类器官的培养液、培养方法存在差异，目前使用气管组织，尤其是儿童PCD患者少量的气管组织培养气管类器官的方法还未见报道，存在较大技术空缺，因此开发利用较少量的气管组织样本(例如儿童支气管镜活检样本)培养PCD气管类器官的培养方法，对临床辅助诊断治疗以及疾病研究而言，具有重要的医学和商业价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种气管类器官的培养液及培养方法。

本发明提供了一种人气管类器官培养液，它是含有如下各终浓度的组分的基础培养基：