[发明专利]基于单链抗体片段的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用，纳米组装体由至少一种重组融合蛋白和疏水性可降解聚酯及其衍生物构建而成。所述重组融合蛋白包括单链抗体片段、连接肽和具有疏水区域的白蛋白，其中单链抗体片段具有竞争性结合靶点、抑制信号通路、激活信号通路、靶向抗原的作用中的至少一种。本发明还公布了单抗抗体片段‑白蛋白重组融合蛋白的制备方法以及纳米组装体的构建方法。本发明所述纳米组装体提供了一种全新的单特异性、双特异性或多特异性抗体的构筑方法，该纳米组装体可用于肿瘤、自身免疫疾病等疾病的治疗。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是涉及一种基于单链抗体片段的重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法与应用。

背景技术

以免疫检查点阻断抗体为代表的单克隆抗体药物已成为全球生物制药领域的新热点，已上市的PD1/PDL1、CTLA4单抗药物正在深刻地改变肿瘤治疗的格局。目前国内已有10余款PD1/PDL1单抗药物被批准用于非小细胞肺癌、黑色素瘤等不同类型肿瘤的治疗。同时，针对T细胞的其它免疫检查点分子(TIGIT、OX40、LAG3、TIM3等)以及其他免疫细胞(包括巨噬细胞、自然杀伤细胞等)的单抗药物的研发也在如火如荼地进行。

免疫检查点单抗药物展现出巨大的商业价值和广阔的临床应用前景，但不同类型肿瘤以及同种类型肿瘤不同患者对该类免疫疗法的反应差异很大，临床应答率总体偏低。近年来，双特异性抗体，甚至多特异性抗体作为一种有效的策略日益引起重视，被开发出来用于克服单抗药物效价不足的问题。例如，美国食品药品监督管理局2014年批准用于前体B细胞前体急性淋巴性白血病治疗的Blinatumomab是一种CD19 x CD3双特异性抗体，其能够同时结合B淋巴母细胞表面的CD19分子和T细胞表面的CD3分子，激活T细胞的同时桥接两种细胞，进而增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤。有研究表明，三特异性抗体相较于双特异抗体和单克隆抗体具备更强的肿瘤识别和杀伤能力。例如，法国赛诺菲公司研发的CD3 x CD28 xCD38三特异性抗体不仅具备CD3 x CD38双特异性抗体桥接效-靶细胞和活化T细胞的能力，还能同时提供激活和共刺激信号，阻止T细胞凋亡，进而发挥更强的抗肿瘤效应。双/多特异性抗体虽然有望提高抗体的效价和肿瘤治疗效果，但其结构设计和生产过程相较于单克隆抗体复杂性大幅增加，以基因重组技术制备双特异性抗体为例，在表达双特异抗体时理论上会产生10种以上副产物。虽然研究人员发展出分子设计策略来减少某种副产物的产生，而不能完全消除全部的副产物，这些都对下游工艺开发提出了重大挑战。

纳米颗粒作为一类高效的药物递送载体，被广泛应用于改善小分子药物、蛋白质药物、核酸类药物的代谢行为和药效。纳米载体在免疫检查点阻断抗体等抗体类药物的递送上已展现出独特的优势。尤其需要指出的是，将两种或多种单克隆抗体药物固定在纳米粒的表面，不仅能够实现抗体药物的多特异性，还能实现“多价态”(多个抗体分子固定于同一颗粒表面)，这可能是“载体化”抗体药物具有更高效抗肿瘤效应的重要原因。

如前所述，将多种单抗药物连接在纳米载体表面是一种极具潜力的提高抗体疗效的策略。然而，已报道的固定抗体的方式主要是利用抗体药物分子上的氨基、羧基、巯基等基团将其键合到颗粒表面，但这些方法存在诸多问题，如反应和纯化过程复杂，还会破坏抗体的高级结构或封闭治疗型抗体的抗原识别区，显著降低抗体识别抗原的能力等。

单链抗体片段(single-chain variable fragment,scFv)是指通过基因重组技术，人工表达保留了与抗原特异性结合的免疫球蛋白Fab片段中简要部分，由一段重链和一段轻链组成，两链之间通过短多肽铰链连接，scFv既保留了抗原识别和结合的特性，同时其分子小，可以与多肽或蛋白重组成融合蛋白。血清白蛋白等蛋白质被广泛用于药物递送载体的构建，Abraxane等载药白蛋白纳米药物已被批准用于恶性肿瘤的治疗。如果将scFv与血清白蛋白等重组成融合蛋白，然后将两种或者多种融合蛋白组装在一起，即可以构建出一种新型的双/多特异性抗体，这类抗体具有多特异性、多价态等特性，有望在肿瘤等疾病中发挥重要作用。

发明内容