[发明专利]一种CRX基因缺失型突变的猫突变体的构建方法及应用

说明书

本发明提供一种CRX基因缺失型突变的猫突变体的构建方法，包括：通过敲除猫的野生型CRX基因一个或多个外显子序列的部分序列，使CRX基因不能正常表达。本发明获得的CRX基因敲除猫，将为医学研究提供具有巨大应用价值的疾病动物模型，为推动遗传性眼部疾病的研究和眼部疾病药物的筛选奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种CRX基因缺失型突变的猫突变体的构建方法。

背景技术

视网膜退化是由环境、遗传等多因素导致的视力退行性疾病。视网膜退化病因复杂，其发病与多种因素有关。CRX基因是OTD/OTX同源结构域蛋白家族的成员之一，该家族是哺乳动物眼睛发育所必需的转录光受体转录因子网络中的一员，控制光受体基因的表达、发育和维持。在杆状和锥状光感受器的发育、成熟和持续生存至关重要。与CRX基因相关的视网膜退化疾病具有显性遗传性，这种疾病多发生于儿童时期，导致锥状细胞营养不良，光感受器细胞退化死亡，早期仅有的现象可能是外观正常的黄斑或黄斑细小性病变以及视盘苍白。进展过程中，在黄斑区出现类似骨针状色素沉积物，视网膜血管衰减，视盘蜡质苍白，最后出现各种程度的视网膜萎缩。视力开始丧失，最终导致失明，影响了全球大概2百万的人口。

视网膜退行性疾病为患者和家属带来巨大的痛苦和社会负担。因此，需要建立视网膜退化的动物模型，从而对其病因和治疗药物进行深入研究，虽然啮齿类动物是最常用的动物模型，但啮齿类动物视网膜退化形成的病理改变，尤其是后期病变与人体差距较大。

猫是目前基础医学和教学中最常用的实验动物，尤其在生理、药理和病理学等实验中起着重要的作用。猫在遗传性疾病方面与人类也比较相似。且猫的遗传性疾病少，实验重复性好，血液循环系统和神经系统尤其发达，生殖和内分泌系统与人类类似。尤其适合药理、毒理、眼科、外科、产科、皮肤科、心脑血管系统等方面的研究。同时，作为眼科疾病模型，猫有一个光感受器密度更高的中央区域，富含锥状光感受器，这与人类黄斑有很强的相似性，这也是其他非灵长类实验动物所不具备的优势。另外猫体型较小，饲养简单方便，易于操作，被国际医学、生物学界公认为比较理想的实验动物。

目前常用的制备动物疾病模型的主要方法包括：饲喂法、机械损伤及免疫学方法等。它们为测试治疗方法的有效性提供了基础，包括使用药物和基因替换、新的遗传方法(siRNA)、干细胞治疗、手术干预，如视网膜移植、以及使用眼或视网膜义肢。由于饲喂法、机械损伤和免疫学方法均在健康动物基础上，采用特殊方法诱导其出现疾病表现。这些诱导模型存在诱导效果不稳定及饲喂诱导周期长，无法遗传、表型持续时间短，无法真实模拟体内发病机制，尤其是遗传病发病机制等情况。

利用基因工程方法对非灵长类哺乳动物进行基因改造或转基因修饰建立疾病动物模型可以克服上述诱导动物模型的缺点。目前，在啮齿类动物如小鼠、大鼠、兔及家畜如猪、牛、犬等动物上已经陆续有基因编辑动物诞生。而猫属多次发情动物，发情周期短，生育率高，生理机能等与人类相似，尤其适合进行基因编辑制备人类疾病的动物模型。而猫作为半驯养动物，生殖机理研究不如其他家畜透彻，辅助生殖技术和胚胎工程技术研究不多。造成对猫卵母细胞、受精卵及胚胎体外获取的难度极大，进而抑制了对猫生殖细胞体外操作的研究发展。致使利用基因敲除、基因修饰和基因插入技术制备疾病模型猫的难度大为增加。因此，即便世界上对猫疾病模型的需求很大，但鲜有成功建立基因敲除或基因修饰疾病模型猫的报道。猫视网膜退化模型更是没有相关研究。

因此，非常需要建立基于基因编辑和转基因技术的视网膜退化模型猫，这样的基因编辑症状为原发性症状，疾病表型持续时间长，具有可以遗传的特点，可通过自然繁殖获得子代疾病模型猫。通过短时间的大量繁殖，为人类眼科视网膜退化的研究和相关治疗手段的开发提供合适的基因敲除或者转基因修饰实验动物模型。

发明内容