[发明专利]一种测序信号归一化的方法

说明书

本发明提供了一种稳定高效的测序信号归一化方法，独创地利用了随机序列区的群体信号均值进行衰减拟合和均值校正，利用校正序列区的已知信号，可以获得测序的单位信号。相对于单点归一化方法，本发明的群体归一化方法具有更高的可靠性和准确性，并能够更加高效而有针对性地处理测序数据。

技术领域

本发明涉及一种测序信号归一化的方法，属于基因测序领域。

背景技术

在所有的边合成边测序的测序体系中，测序信号的强度都与作为反应物的模板DNA分子量成正比，随着测序反应轮数的增加，模板DNA分子会随着加热、光照、通电、试剂冲刷等各种物理化学扰动逐渐损失，其损伤的机理在不同测序仪中可能各不相同，但造成的结果都是相应的测序信号逐渐下降。测序信号的下降若不能被正确地估计和校正则会影响对测序信息的读出，可能导致测得碱基个数产生偏差，或者对测得碱基种类发生误判。因此对测序信号衰减的校正是所有测序仪技术中必不可少的一个关键步骤。

Ion Torrent测序仪采用了基于单个测序点的一倍信号分段拟合衰减的方法，单个数据点能提供的数据量是十分有限的，如果要提高信息量需要尽量提高读长增加测序轮数，然而测序轮数大的信号本身质量也会越来越差，总体而言这种方法的信噪比十分受限，对衰减的校正准确度不高。在单位信号的计算上Ion Torrent采用了校正序列区信号的前4轮对ATCG四碱基各测量一个一倍信号，分别用这4轮信号标定单位信号，此方法的设计受限于其电化学测序的信号生成机理，4碱基信号不一致性较大，必须分别进行标定，效率偏低。

因此，需要开发一种可以用于简并测序，且更加准确、效率更高、抗噪性更强的衰减校正方法。

发明内容

本发明公开一种测序信号归一化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.利用基因测序芯片对由待测基因构建的文库进行多轮测序反应，得到多幅原始测序图像；所述文库中校正序列区紧邻待测基因，所述校正序列区的核苷酸序列已知；一轮测序反应指的是，提供一种测序试剂，将该种测序试剂中具有可检测标记的核苷酸单体掺入所述文库之后检测所述可检测标记生成的荧光信号的过程；

B.在每轮测序反应所得的所述原始测序图像中，对图像中的亮点提取获得初步信号，计算初步信号的平均值作为该轮测序反应的初始群体信号强度；所述亮点对应于芯片上发生核苷酸单体掺入的微反应室；

C.利用除去所述校正序列区之后的每一轮测序反应对应的所述初始群体信号强度进行指数衰减拟合，得到拟合曲线和相关参数；

D.根据所述拟合曲线和相关参数，计算得到所述校正序列区的调整后的信号强度，根据调整后的部分校正序列区信号总和及其对应的核苷酸总数，得到所述亮点处的单位信号；

E.结合单位信号和所述拟合曲线得到所述亮点在每一轮测序反应的归一化信号值。

根据优选的实施方式，所述测序为3’端不封闭的测序反应，在测序反应中，包括两种不同的测序试剂：第一测序试剂和第二测序试剂；两种测序试剂循环加入；其中所述第一测序试剂包含具有可检测标记的两种不同的核苷酸单体；所述第二测序试剂包含具有可检测标记的两种核苷酸单体，且所述两种核苷酸单体不同于所述第一测序试剂中存在的所述核苷酸单体，并且其中所述第二测序试剂是在提供了所述第一测序试剂随后提供的，将所述核苷酸单体掺入所述文库之后检测所述可检测标记生成的荧光信号。

根据优选的实施方式，所述核苷酸单体为5’端多磷酸修饰有荧光切换性质的荧光团的核苷酸，所述的荧光切换性质指的是测序反应后荧光信号相比测序反应前有明显改变。

根据优选的实施方式，所述文库包括：至少一个测序引物结合位点、0个或至少一个索引序列、校正序列区、待测基因。

根据优选的实施方式，所述校正序列区的核苷酸序列已知，组成所述校正序列区的核苷酸个数为6-10个，所述校正序列区对应的测序反应轮数大于2。