[发明专利]一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法，其特征在于，以艰难梭菌体内的PFOR酶为靶点，通过测试FMT供体提供的粪菌液对PFOR酶的抑制率，筛选预测和/或评价FMT对于艰难梭菌感染的治疗效果，具体包括以下步骤：

（1）培养带有PFOR酶质粒的大肠杆菌；

（2）诱导带有PFOR酶质粒的大肠杆菌产生PFOR酶；

（3）提取大肠杆菌产生PFOR酶；

（4）制备FMT供者所提供的粪菌液；

（5）配制PFOR酶的反应体系，通过体外实验，检测FMT供者所提供的粪菌液在PFOR酶的反应体系中，对PFOR酶的抑制情况；

（6）根据FMT供体提供的粪菌液对PFOR酶的抑制率，筛选预测和/或评价FMT对于艰难梭菌感染的治疗效果。

2.根据权利要求1所述的一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中，培养带有PFOR酶质粒的大肠杆菌的具体如下：

（1.1）制备LB培养基，具体包括液体培养基和固定培养基：

（1.1.1）液体培养基的配制：将5g LB肉汤粉末溶于500ml蒸馏水，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压灭菌15min，培养瓶内液体体积不超过瓶本身量程的1/3，待其冷却后加入氨苄青霉素，使其终浓度为100μg/mL，混匀即可；

（1. 1. 2）固体培养基的配制：将3.5g LB琼脂粉末溶于100ml蒸馏水，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压灭菌15min，65℃将培养基从高温灭菌锅中取出，在固体培养基凝固之前加入终浓度为100μg/mL氨苄青霉素后混匀，然后将培养基倒入培养皿中，静置待其冷却凝固；

（1.2）选取带有PFOR酶质粒的大肠杆菌进行平板接种：挑取单菌落，在已加入氨苄青霉素的固体培养基中进行平板划线，置于细菌培养箱中，37℃，培养12小时左右；

（1.3）培养12小时后，在已经生长细菌得到平板上挑取单菌落到含有50ML已加入氨苄青霉素的液体培养基的离心管中，放在震荡培养箱中，37℃，220rpm,200min，震荡200分钟后，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，IPTG终浓度为0.5mMol/ml，置于震荡培养箱中，25℃，220rpm，20h。

3.根据权利要求1所述的一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（2）中，诱导带有PFOR酶质粒的大肠杆菌产生PFOR酶的具体过程为：使用100μg/ml浓度氨苄青霉素诱导大肠杆菌质粒表达，使用终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导PFOR酶的产生。

4.根据权利要求1所述的一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（3）中，提取大肠杆菌产生PFOR酶的具体过程为：取50ml诱导菌液，12000g，4℃，5min，离心去上清；纯水等体积重悬，再次离心去上清；然后10mL纯水重悬，10mL菌液冰上400W超声5s，间隔5s，持续10min，所获得的溶液即含有PFOR的粗酶液。

5.根据权利要求1所述的一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（4）中，制备FMT供者所提供的粪菌液的具体过程为，挑选健康状况、饮食习惯良好的FMT供者既往提供的粪便，将其均质，在最终浓度为50mg粪便/mL的无菌盐水中稀释，收集的样本以100g离心2分钟，收集上清液并通过70μm和0.22μm滤膜，收集上清。

6.根据权利要求1所述的一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（5）中，PFOR酶的反应体系具体为，pH=7.4的100mM磷酸钾缓冲液、10mM丙酮酸钠、ε=9.2mM^-1·cm^-1at546nm的5mM1,1'-二苄基-4,4'-联吡啶鎓盐二氯化物水合物、0.18mM辅酶A、1mMMgCl₂。

7.根据权利要求1所述的一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（5）中，通过体外实验检测FMT供者所提供的粪菌液对PFOR酶抑制情况的具体过程为：在PFOR酶的反应体系中加入50μL粗酶液和10μL粪无菌液，定容至200μL。