[发明专利]一种高产大麻二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组酿酒酵母，表达合成大麻萜酚酸途径的酶、能够合成大麻萜酚酸，其特征在于，表达大麻二酚酸合成途径中的大麻二酚酸合成酶，部分内源性基因被过表达或敲除，所述部分内源性基因包括：Fad1、Fmn1、Hac1、Pep4、Prb1、Mrs2、Gal80、Gal4、Erv29、Der1。

2.根据权利要求1所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，部分内源性基因被过表达或敲除是(a)～(k)任一种：

(a)过表达Fad1、Fmn1，

(b)过表达Hac1，

(c)敲除Pep4，

(d)同时具有(a)、(b)、(c)，

(e)在(d)的基础上，敲除Prb1，

(f)在(a)、(c)的基础上，敲除Mrs2、敲除Gal80、过表达Gal4，

(g)在(a)、(c)的基础上，敲除Mrs2、敲除Gal80、过表达Gal4、过表达Erv29，

(h)在(a)、(c)的基础上，敲除Der1，

(i)在(c)的基础上，敲除Gal80、过表达Gal4，

(j)在(a)、(c)的基础上，敲除Gal80、过表达Gal4，

(k)在(a)、(b)、(c)的基础上，敲除Gal80、过表达Gal4。

3.根据权利要求1所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述编码大麻二酚酸合成酶的基因的核苷酸序列是SEQ ID NO:1。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，表达大麻二酚酸合成酶是指将编码基因插入到酿酒酵母基因组上、通过内源性pGal1启动子启动表达。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述大麻二酚酸合成酶通过或不通过linker与标签蛋白进行融合表达。

6.根据权利要求5所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述linker的序列如SEQ IDNO:2～SEQ ID NO:8任一所示。

7.根据权利要求5所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述标签蛋白是TrxA、MBP、DsRed.T3、GFP或mCherry。

8.根据权利要求1所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述过表达是指把基因上调表达，即该基因被过度的转录、翻译，终基因表达产物超过正常水平。

9.根据权利要求1所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述敲除是指令特定基因功能丧失。

10.构建权利要求1～9任一所述重组酿酒酵母的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)PCR扩增得到需要过表达的基因的表达盒，整合到酿酒酵母基因组上；或者，PCR扩增得到用于敲除基因的同源片段，用同源片段替换酿酒酵母基因组上的待敲除基因；

使用CRISPR-Cas9技术实现酿酒酵母基因组上的基因敲除和插入；

(2)筛选获得阳性克隆。

11.权利要求1～9任一所述重组酿酒酵母在生产大麻二酚酸中的应用。

12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)活化培养重组酿酒酵母，并培养得到重组酿酒酵母种子液，

(2)将重组酿酒酵母种子液转接到合适产大麻二酚酸的培养基中，在适宜条件下培养重组酿酒酵母使之产大麻二酚酸。

13.权利要求1～9任一所述重组酿酒酵母在生产大麻二酚中的应用。