[发明专利]一种PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒

说明书

本发明公开了一种PLGA微球‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒，属于分子生物学和医药领域。所述试剂盒具体包括：PLGA微球，PLGA微球表面羧基活化剂，dCas9蛋白，杜氏肌萎缩症检测用sgRNA。所述杜氏肌萎缩症检测用sgRNA，为SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.10中的任意一条。本发明是利用CRISPR技术将dCas9蛋白‑sgRNA‑捕获的杜氏肌萎缩症相关的特定基因片段结合，用PLGA微球免疫共沉淀法抓取dCas9蛋白与基因片段的复合体，并分别分析dCas9蛋白和基因片段含量。这是一种快速进行早期筛查杜氏肌萎缩症患者的方法。

技术领域

本发明属于分子生物学和医药领域，尤其涉及一种PLGA微球-CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒。

背景技术

近年来，随着各种靶标特异性核酸检测工具的开发和全基因组测序技术的发展，各种病理学的生物标志物的分析和鉴定方法得到了迅速发展。在过去的30年中，基于聚合酶链式反应(PCR)的核酸诊断测试方法已经得到极大的发展，甚至已经成为病毒核酸检测的金标准。尽管如此，PCR核酸检测方法因为需要多步反应，多种试剂以及要求训练有素的操作人员和复杂的仪器，在临床应用时仍然耗时且昂贵。因此，新的核酸分子检测方法需要克服常规核酸检测策略的局限性，以提供低成本、高集成度、紧凑便捷的核酸诊断工具，从而扩展其临床应用。

在分子生物学领域，基于常间回文重复序列丛集(CRISPR)及相关的核酸酶(Cas)的基因编辑技术无疑是受到最广泛关注。CRISPR-Cas分子系统可以通过非同源末端连接或同源性定向修复来纠正基因突变，从而提供了基因治疗的新策略而备受关注。此外，这种强大的基因靶向编辑技术不仅仅在治疗方面，同时也可被用作核酸突变位点靶向检测的新方法。CRISPR-Cas蛋白可以在单链引导RNA(sgRNA)的引导下，成为序列特异性靶向和检测的强大工具。核酸酶失活的Cas9(dCas9)是Cas9的一种无酶活性的突变体，其中其核酸内切酶活性无效。其制备方法是化脓性链球菌Cas9蛋白的HNH域中引入H840A突变，并在RuvC域中引入了D10A突变，即可产生核酸酶缺陷型dCas9，也称为dCas9空突变体(null mutant)。尽管Cas9的这个“失活”版本不再能够切割DNA，但在sgRNA的引导下，它仍然能够以相同的精度靶向结合目标序列的DNA分子。近年来，CRISPR/dCas9的应用得到了扩展和多样化。在本发明中，不具备内切活性的CRISPR-dCas9蛋白与sgRNA的形成分子复合物，可以通过扫描整个基因组样本，逐步解开DNA双螺旋结构，寻找并结合目标突变位点，从而实现靶向检测基因组治病突变位点的功能。

免疫沉淀法一般是指采用固定在固相支持物上的结合蛋白或相关抗体，对蛋白进行亲和纯化。这种方法可以采用固定在特殊材料的微珠支持物上的特定抗体从复杂的混合物中纯化单一蛋白。免疫共沉淀法与免疫沉淀法的原理十分相似，但免疫共沉淀法的目标更倾向于分离抗原及与抗原结合的蛋白质。常用的微珠支持物为琼脂糖树脂，常用的固定亲和有蛋白A、蛋白G、蛋白A/G等。但是，这种微球在实际应用中尝尝会在体系中引入自身亲和蛋白的干扰，对下游酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹法(Western blot)等后续蛋白检测造成背景干扰。

PLGA(乳酸-乙醇酸共聚物)是通过两种不同的单体(乙醇酸和乳酸的环状二聚体(1,4-二恶烷-2,5-二酮))的开环共聚而合成的。由于其具有生物降解性和生物相容性，因此已在美国食品药品管理局(FDA)批准的治疗方案中被广泛使用。

杜氏肌萎缩症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是由X染色体上肌营养不良蛋白基因突变引起的，该突变可发生在DMD基因(Gene ID：1756，NM_004006.3)所有79个外显子上，最常见的是外显子2-10和45-55的大缺失。这些突变导致功能障碍性肌营养不良相关蛋白的表达，引起肌肉组织的持续变性，进而发展为呼吸系统严重并发症，从而导致DMD患者的高死亡率。当前检测DMD的方法包括基因测序以筛查肌营养不良蛋白基因内常见的缺失，以及结合肌酸检测技术测量肌酸激酶水平的组合方法。