[发明专利]一种枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用

说明书

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种枯草芽孢杆菌，该菌种于2021年11月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.23944。奔赴买那个还公开了该草芽孢杆菌的培养方法以及用该草芽孢杆菌制备D‑阿洛酮糖的应用。本发明显著提高了D‑阿洛酮糖生产过程中的转化率；且产生的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的酶作用最适pH范围广泛，更利于生产过程中对条件的控制。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌，属芽孢杆菌属，为革兰氏阳性需氧型菌。单个细胞0.7-0.8×2-3微米，芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色至淡黄色。是食品级微生物，属于GRAS级微生物，不存在内毒素等食品安全问题，被广泛应用于各种工业酶制剂中。

D-阿洛酮糖是稀有糖的一种，是D-果糖C-3位的差向异构体。D-阿洛酮糖不仅是一种无热量的甜味剂，而且可作为其他稀有糖生产的重要原料。目前D-阿洛酮糖的生产方式主要为生物合成法，但普遍存在转化率低、酶活稳定性差等问题。

中国专利文献CN 104894047 B(申请号201510294626.2)公开了基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。该发明得到的枯草芽孢杆菌发酵液总酶活达16U/mL，但还达不到工业生产的要求。

因此，寻找一种产高酶活的D-阿洛酮糖3-差向异构酶生产菌株及其合适的培养条件成为解决D-阿洛酮糖大规模生产应用的关键。

发明内容

本发明的目的是解决当前D-阿洛酮糖生产过程中转化率普遍偏低且酶活稳定性差的问题，提供了一种枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。该枯草芽孢杆菌产酶酶活稳定，且其培养方法可高效转化D-果糖生成D-阿洛酮糖，可显著降低生产成本。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种枯草芽孢杆菌，于，2021年11月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.23944。

所述枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）出发菌株活化，将出发菌株在LB培养基中摇瓶培养得到菌体，然后将菌体用生理盐水调整菌悬液活菌数为10⁷-10⁸ CFU/mL；

（2）紫外诱变，取倒有菌悬液的培养皿放在紫外灯下进行诱变，然后用无菌生理盐水将诱变后的菌悬液稀释100倍，均匀涂布于固体培养基中进行培养；

（3）复筛，对致死率在70-80%的菌株进行复筛，复筛时挑选菌落大、边缘不整齐、镜检为革兰氏阳性菌、细胞形态成短杆状的单菌落进行酶活力验证，得目标菌株。

所述步骤（1）出发菌株活化中药瓶培养的条件为37℃、200r/min的摇床上振荡培养，达到对数期，将培养好的菌液4000r/min条件下离心10min，得到菌体。

所述步骤（2）紫外诱变中的诱变条件为在紫外灯下方30cm处，照射3min。

所述草芽孢杆菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。

一种利用权利前述的草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤a取枯草芽孢杆菌的菌体发酵液离心取沉淀，沉淀用缓冲试剂重悬；

步骤b取重悬后菌液用高压均质机连续均质3次，进行离心，上清液经0.45μm滤膜过滤即为粗酶制剂；

步骤c将步骤b制得的粗酶制剂与D-果糖溶液混合转化、离心，得到D-阿洛酮糖粗液；

步骤d将步骤c制得的阿洛酮糖粗液经脱色过滤、离子交换、真空浓缩、色谱分离、浓缩、结晶、干燥后，制得晶体阿洛酮糖。