[发明专利]一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法，通过透析法制备副猪嗜血杆菌OMP5抗原的免疫刺激复合物(ISCOM‑OMP5)，并将ISCOM‑OMP5作为副猪嗜血杆菌疫苗的佐剂，通过小鼠模型进行免疫学评价。结果显示，电镜下观察所制备的ISCOM‑OMP5具有ISCOM的典型蜂窝状结构，直径为30nm‑40nm，OMP5蛋白的包封率达85.8%；小鼠二免后1周即可在小鼠血清中检测到高水平的特异性H.parasuis抗体，小鼠体外淋巴细胞增殖及细胞因子检测结果，ISCOM‑OMP5对小鼠机体的体液免疫具显著增强作用（P0.01），对IL‑10、IFN‑γ的表达也具显著促进作用（P0.001）。本发明制备的ISCOM‑OMP5可以有效诱导小鼠产生针对H.parasuis的免疫应答，能显著增强免疫效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(H.parasuis)是当前危害规模化猪场最严重的细菌性疾病。该菌主要感染对象为2-28周龄的仔猪以及生长猪，其中对于5-8周龄断奶保育仔猪带来的危害和影响最为突出，保育猪感染主要临床表现为浆膜炎和关节炎等症状，感染率在30-60％，死亡率50-70％。副猪嗜血杆菌血清型复杂多样，依据同型细菌外膜蛋白抗原的不同至少包含15种血清类型，还有30％多未能定性。我国当前优势血清型以4、5、12、13型为主，不同地区血清型存在显著差异性。临床中因抗生素的使用易产生耐药性，使得防治难度大大提升，采用疫苗免疫是防治该病最为经济且有效的方式。

自20世纪疫苗佐剂首次在兽用疫苗中应用以来，由于传统的含油类佐剂易导致肉芽肿、溃疡、发热等免疫副反应，随着科学技术的发展，人们发现的佐剂种类越来越多，免疫刺激复合物(IS-COMs)佐剂于1984年左右由瑞典学者Morein等(1984，Nature)研发得到，主要由脂类、胆固醇、抗原及糖苷Quil-A等组成，其作为抗原传递系统的佐剂，可通过表面疏水作用捕获蛋白抗原，通过内吞作用被APC摄取。免疫刺激复合物(immunostimulatingcomplexes，ISCOM)疫苗抗原递呈系统极为完善，在发挥作用时能够有效的实现抗原高效传递以及提升免疫增强系统。ISCOM可以明显提升T细胞的增殖分化能力，从而刺激机体产生免疫应答，能够使得动物对多种抗原产生抗体应答。ISCOM具备抗原需求小，持续作用久，出现时间早，抗体水平高，且不受已存在抗体或母源抗体影响等特点。由于其不限制疏水膜蛋白的应用，而且生产工艺简便，所以应用范围更广泛。众多实验表明，该佐剂在疫苗应用中具有高度的安全性和免疫原性。目前免疫刺激复合物已在兽医疫苗上得到了广泛应用，适用于豚鼠、猪、牛、狗、兔和绵羊等多种动物，可以介导广泛全面的免疫反应，具有较强的免疫原性和安全性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法，以提高副猪嗜血杆菌疫苗的免疫效果。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方法为：

一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法，步骤如下：

(1)HPS OMP5 PCR引物设计与合成

根据HPSOMP5基因序列(CP001321)，用生物软件Premier Primer5.0设计1对特异性引物P1/P2(P1:CAACCGTAATAGCGTGACCT；P2:CACTTCTTTACTACCCTGAACCT)，扩增HPS OMP5的全基因。送上海生工生物技术有限公司合成。

(2)HPS OMP5基因的克隆及表达载体构建

实验运用了特异性引物P1/P2，按照分子克隆方式针对载体进行克隆，随后采用PCR方法从克隆质粒pMD18T-OMP5中扩增出副猪嗜血杆菌OMP5基因，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，将基因亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，构建重组表达载体，并进行PCR鉴定和酶切鉴定。

(3)重组pET-28a-OMP5融合蛋白的诱导表达及蛋白的纯化检测