[发明专利]一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）HPS OMP5 PCR引物设计与合成；

（2）HPS OMP5 基因的克隆及表达载体构建 ；

（3）重组 pET-28a-OMP5 融合蛋白的诱导表达及蛋白的纯化检测；

（4）副猪嗜血杆菌超声波破碎抗原的制备；

（5）免疫刺激复合物基质的制备与鉴定；

所述免疫刺激复合物基质的制备与鉴定步骤如下：在获得免疫刺激物质时，首先将磷脂酰胆碱和胆固醇加至20% mega-10中，使得其完全溶解后分装并处于低温环境中储存，随后将0.1g QuilA溶于5mL pH为7.2的PBS缓冲液中，溶液终浓度为20mg/mL；取10mg/mL的OMP5 1mL加入非离子活性剂mega-10，使其终浓度为2%，37℃处理12h-18h，使其裂解；随后将其加入脂类贮备液0.1mL和QuilA 5mL，摇匀后于RT下裂解240min；冰浴超声处理，室温下作用1.5h，随后将其处于4℃的环境下放置3天，在前两天将其放置在12000分子量的透析袋，最后一天用30000分子量的透析袋，用0.22μL过滤器过滤；取20μL采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定ISCOM-OMP5中的蛋白含量，取样品进行磷钨酸负染，于透射电镜下观察，过滤除菌后4℃保存。

2.根据权利要求1所述的一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法，其特征在于，所述PCR引物设计与合成的步骤如下：根据HPSOMP5基因序列，用生物软件 Premier Primer5.0 设计1对特异性引物P1/P2，扩增 HPS OMP5 的全基因；

P1:CAACCGTAATAGCGTGACCT；

P2:CACTTCTTTACTACCCTGAACCT。

3.根据权利要求2所述的一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法，其特征在于，所述HPSOMP5 基因的克隆及表达载体构建步骤如下： 运用特异性引物P1/P2，按照分子克隆方式针对载体进行克隆，随后采用PCR方法从克隆质粒pMD18T-OMP5 中扩增出副猪嗜血杆菌OMP5基因，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，将基因亚克隆到原核表达载体 pET-28a（+）中，构建重组表达载体，并进行 PCR 鉴定和酶切鉴定。

4.根据权利要求3所述的一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法，其特征在于，所述重组pET-28a-OMP5 融合蛋白的诱导表达及蛋白的纯化检测步骤如下：将阳性重组表达质粒pET-28a-OMP5接种到相应抗性的LB平板培养基上，37℃过夜培养，从LB培养基上挑选单菌落接种到已加入相应抗性的5ml的LB液体培养基中，200 rpm，37℃过夜培养，将过夜培养的菌液按接种量150-200μl接种于已加入相应抗性的200ml LB液体培养基中，在37℃，200rpm条件下培养至菌液OD600为0.6-0.8，加入终浓度0.4mM 的IPTG开始诱导表达，在200rpm，37℃条件下培养至菌液OD600为1.48-1.52左右，开始收菌，菌液离心，去上清，菌体用10ml包涵体缓冲液重悬，离心，去上清，菌体用于包涵体蛋白的纯化。

5.根据权利要求4所述的一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法，其特征在于，所述超声波破碎抗原的制备步骤如下：将步骤（3）制备得到的菌体用10ml 包涵体缓冲液重悬，在4℃条件下超声破碎，直至菌液透明结束；超声后在4℃条件下离心，取上清20μl，留样电泳，沉淀用10ml包涵体缓冲液重悬并离心去上清；用10ml包涵体洗涤液将裂解后的沉淀重悬，离心，收集沉淀，再用包涵体洗涤液重悬，离心，如此重复3次操作，充分洗去包涵体中的水溶性蛋白，最后一次洗涤收集到的沉淀，用10ml包涵体溶解液重悬，吹打混匀并在斡旋仪上振动使得包涵体蛋白充分溶解，然后在离心，取上清20μl进行电泳；将10ml上清置于透析袋中密封，放入到装有400ml外围透析液的烧杯中，置于4℃，充分平衡；然后用蠕动泵向外围透析液中逐渐缓慢滴加清水，直至外围透析液被稀释10倍，将第一次透析后的样品放入二次透析液中透析至蛋白液中尿素浓度低于0.04M，取样测蛋白浓度、电泳，最后将复性成功的蛋白样品分装保存于-20℃冰箱备用。

6.根据权利要求5所述的一种副猪嗜杆菌佐剂疫苗的制备方法，其特征在于，超声破碎的步骤如下：超声3s，停6s，振幅38%，超声15min，此步骤均在冰浴情况下进行，直至菌液透明结束；第一次透析的时间不少于8h，第二次透析的时间为3-4 h。