[发明专利]用于单细胞中单分子蛋白质与生物分子计数的系统与方法

说明书

本发明属于生命科学技术领域，具体为用于单细胞中单分子蛋白质与生物分子计数的系统与方法。本发明系统包括微注射泵、三维可移动定位样品操作平台、荧光显微镜物镜系统、CCD图像采集系统、荧光图像处理和计数系统、抗体功能化修饰的玻片；在显微镜监视下使用样品操作平台控制吸取皮升体积单细胞，加样到功能化玻片上；在样品微液滴原位进行细胞裂解及目标分子释放，并被玻片上抗体捕集形成单分子层；标记荧光标签后，由荧光成像系统拍摄并完成荧光计数。本发明单次成像可实现对单细胞内1到3000个分子的蛋白质的精准计数，通过多次、多视野拍摄和数据叠加扩大计数范围至10^4。本发明可扩展对皮升级液滴内分子进行分子计数。

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，具体涉及用于单细胞中单分子蛋白质与生物分子精确计数的系统与方法。

背景技术

蛋白质作为所有生物的重要组成部分和功能承担着者，参与从DNA复制到基本细胞功能实现等的全部过程。单个细胞中的蛋白质的组成和丰度保证了其独特的细胞功能和行为，特别是一些超低拷贝数目的蛋白质（单个细胞内拷贝数低于1000）在细胞信号网络中发挥起到关键作用，同时也影响着细胞的一些重要的生理学和病理学行为。然而这些单细胞中的蛋白难以使用传统的、基于大量样品的蛋白质定量方法进行定量，这些信息的缺失严重影响我们对一些关键的生命过程的理解，尤其是一些与疾病的发生、发展相关的过程。

目前单细胞蛋白质的定量方法采用的大多是基于常规蛋白质定量方法的改进和创新，具有这些方法的一切限制，最重要的是仍无法对低拷贝蛋白数目蛋白进行精准定量。这些方法甚至需要进行单细胞化的适配，增加了额外的设备和实验流程，花费高，学习曲线长。近年来也有研究者尝试设计新的单细胞蛋白质定量方法解决此问题，如Guan等报道了一种基于激光诱导荧光的低成本平台，用于对细胞内的可溶性蛋白进行定量；A.Salehi-Reyhani等开发了一种通过对荧光图像进行化学计量分析对单细胞细胞内蛋白进行绝对定量的方法。这些方法虽然实现了对单细胞内低拷贝蛋白的定量，但他们都将定量的目标蛋白限制在了细胞内蛋白，这也限制了这些方法的进一步推广。

基于以上认识，为了解决单细胞低拷贝数目蛋白的计数问题，本发明设计了一种用于蛋白质与生物分子计数的系统，以皮升级液体体积对任意靶细胞进行取样，尽可能地降低样品损失并提高了目标蛋白的浓度；同时结合荧光成像和计数方法，完成对单细胞内任意蛋白分子及生物分子进行计数。平台结构简单，操作学习曲线短，利于生命科学中的应用和推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构简单、操作方便且利于推广的于单细胞中单分子蛋白质与生物分子计数的系统及方法。

本发明提供的于单细胞中单分子蛋白质与生物分子计数的系统，包括：微注射泵1、三维可移动定位样品操作平台2、摄像头4、荧光显微镜物镜系统5、CCD图像采集系统6、荧光图像处理和计数系统7、玻片8；其中：

所述微注射泵1 连接有微量注射器，微注射泵1用于精准控制皮升级体积的单细胞或液体吸取和排出；

所述三维可移动定位样品操作平台2，设置有带尖端的毛细管3，毛细管3 的内径为10-50微米，用于吸取含有单个细胞的皮升级液体样品；该样品操作平台2可作三维移动，并对样品进行精确定位；其中，毛细管3与微注射泵1连接；

所述荧光显微镜物镜系统5，用于实时观察样品操作过程及毛细管内液体液面的变化；在荧光成像阶段用于目标分子单分子层的定位和辅助成像；

所述玻片8，经过抗体功能化修饰，其表面覆盖有非水溶性油层（或油滴）；含有单细胞的微液滴样品放置于油层之下；所述玻片8放置于荧光显微镜物镜系统5的物镜台上；

所述CCD图像采集系统6，其功能为实现目标生物分子的荧光成像；

所述荧光图像处理和计数系统7，用于对所拍摄的荧光图像进行处理和荧光分子计数；

所述辅助摄像头4，设置于所述玻片8的上方且有一定的倾斜角度，用于辅助观察实时观察样品操作过程及毛细管内液体液面的变化；