[发明专利]适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框及其应用

说明书

本发明属于生物技术与发酵工程领域，提供了适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框及其应用，本发明通过将透明颤菌血红蛋白基因vgbS与弗氏链霉菌中碳酸酐酶CynT的信号肽SPCynT、链霉菌组成型强启动子PkasO*和弗氏链霉菌终止子Taph相连，组成VHb蛋白表达框PkasO*‑SPCynT‑vgbS‑Taph，所述表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明的VHb蛋白表达框P_kasO*‑SP_CynT‑vgbS‑T_aph具有更高效的表达VHb的能力，将其应用于弗氏链霉菌中，VHb的表达效果更好，弗氏链霉菌的发酵产物产量更高，新霉素的产量至少提高了14.9%。

技术领域

本发明属于生物技术与发酵工程领域，具体涉及适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框及其应用。

背景技术

链霉菌在分类学上属于原核生物界放线菌目链霉菌科，具有多样化的基因组和极高的GC（70～76%）含量。自然界约70％的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生。新霉素是由弗氏链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素，能够干扰蛋白质合成，是国内外最为常用的兽用抗生素之一。其主要成分为新霉素B和C，以及少量新霉素A。新霉素B相对其他组分而言活性强、毒性低，是发酵过程中需要监测的主要组分。

表达载体pSET152是大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，其中具有接合转移的oriT功能区域、链霉菌筛选标记-安普霉素抗性基因acc3(IV)、整合酶基因int(φC31)、链霉菌温和噬菌体φC31的attP位点。因此，pSET152可利用简便高效的属间接合转移法导入链霉菌，并可通过特异性重组整合在链霉菌染色体的attB位点上，随着宿主染色体的复制而复制。

透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）是目前为止研究最为透彻的原核生物血红蛋白，来源于一种革兰氏阴性菌—透明颤菌。自然状态下的VHb以同型二聚体形式存在，两个亚基由146个氨基酸残基形成6个α-螺旋（A，B，E，F，G，H），相对分子量为15.8kDa，且各含有一分子b型血红素。低氧条件下，VHb可以与氧结合，发生构象变化，又能够与氧解离，将氧传递给呼吸链，调节呼吸链末端氧化酶的活性。目前，VHb已在多种宿主细胞（大肠杆菌、假单胞菌、烟草、水稻、斑马鱼等）中成功表达，用于改善动植物细胞特性、改善细菌在高耗氧或氧气受限的高密度发酵中的生长情况。VHb的编码基因为：vgb基因。依据弗氏链霉菌密码子偏好性优化vgb基因得到：vgbS基因。

陈文青等基于质粒pWQ2005中的硫链丝菌素诱导启动子PtipA启动vgb的表达，利用接合转移法将vgb基因整合到泰乐菌素的生产菌株弗氏链霉菌中，但由于PtipA启动子受到硫链丝菌素诱导，而在发酵过程中添加硫链丝菌素对菌体生长不利。并且，现有技术中均是单独将血红蛋白基因—vgb基因在链霉菌中进行强化表达，其表达效果以及促菌体生长和发酵产物合成的效果有限。如何构建适用于弗氏链霉菌的高效表达的VHb表达框一直亟待研究。

信号肽（又称“穿膜肽”）是蛋白质N-末端一段编码长度为5-30的疏水性氨基酸序列，用于引导新合成蛋白质向通路转移的短肽链。信号肽存在于分泌蛋白、跨膜蛋白和真核生物细胞器内的蛋白中。信号肽酶有三种：SPaseI、SPaseII和SPaseIII。目前尚无法根据前人结果选择合适的信号肽来构建适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框进行弗式链霉菌中透明颤菌血红蛋白的高效表达及基于透明颤菌血红蛋白高效表达的代谢产物的高效合成。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种适用于弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）的透明颤菌血红蛋白表达框。

适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框，所述表达框的核苷酸序列为SEQID NO.1所示。