[发明专利]转录组及代谢组鉴定南瓜运输mRNA响应低温代谢机制的方法

权利要求书

1.一种转录组及代谢组鉴定南瓜运输mRNA响应低温代谢机制的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将黄瓜和南瓜种子处理后进行播种，黄瓜播种一周后，进行南瓜播种；

2)待长至下胚轴粗度一致时，黄瓜为接穗，南瓜为砧木进行下胚轴嫁接；此外，黄瓜进行自嫁接；南瓜进行自嫁接；南瓜为接穗，黄瓜为砧木进行下胚轴嫁接；

3)嫁接后一周，砧木和接穗分开取样，样品用于后期砧穗互作的研究；

4)嫁接7d后，选取各嫁接组合长势一致的植株进行低温处理，将低温处理之后的嫁接组合植株第一真叶和根部组织迅速放入液氮中，每个样品每个处理三次生物学重复，每个重复3-8株；取部分做污染性鉴定以及嫁接苗嫁接口连接性确定，然后将速冻的组织做转录组分析；

5)修正基因组及转录组文库构建：重新构建黄瓜和南瓜修正基因组数据，提取每个嫁接组合植株第一真叶和根部组织中总RNA和基因组DNA，进行基因组和转录组测序；转录组文库构建使用Illumina HiSeq2500平台进行150bp的成对末端阅读片段测序；

6)根据FPKM值计算嫁接组合植株中南瓜和黄瓜组织DEG；

7)每个嫁接组合植株的各组织的样品包括4-6个生物学重复，液氮速冻后将其储存在-80℃超低温冰箱中，进行非靶向代谢组学测定；根据不同代谢物的离子强度计算相应的差异强度代谢物；

8)转录组结合基因组重测序鉴定响应低温的砧穗间运输性mRNA；

9)使用在线数据分析平台Omic Share Tools对异源嫁接植物和自嫁接植物在正常和低温处理条件下相同组织的DEGs和运输mRNA的基因ID列表进行GO富集和KEGG途径分析；

10)DEGs、差异强度代谢物、运输mRNA和代谢途径的综合分析。

2.如权利要求1所述的转录组及代谢组鉴定南瓜运输mRNA响应低温代谢机制的方法，其特征在于：步骤1)中，种子处理为：将黄瓜和南瓜种子置于55℃温水中浸泡20分钟，然后28℃浸泡20min后，放置在28℃恒温培养箱内黑暗条件培养24h。

3.如权利要求1所述的转录组及代谢组鉴定南瓜运输mRNA响应低温代谢机制的方法，其特征在于：步骤4)中，低温处理为：相对湿度70％；16h/8h光照/黑暗；4℃/4℃昼/夜；光照强度190-600μmol/m²s。

4.如权利要求1所述的转录组及代谢组鉴定南瓜运输mRNA响应低温代谢机制的方法，其特征在于：步骤6)中，每个嫁接组合植株响应低温的同一组织样品的转录本丰度通过FPKM方法计算，计算公式如下所示：

其中C和N分别表示与单基因簇唯一比对的映射读数和与总单基因簇唯一比对的测序读数的总数，L表示单基因簇的碱基对长度。

5.如权利要求1所述的转录组及代谢组鉴定南瓜运输mRNA响应低温代谢机制的方法，其特征在于：步骤6)中，根据FPKM值计算嫁接组合植株中南瓜和黄瓜组织DEG的方法如下：(1)未经低温处理的异源嫁接植物和同源嫁接植物在同一组织中的转录本丰度差异被记录为Δ1；(2)在6h的低温处理下，异源嫁接植物和同源嫁接植物在同一组织中的转录本丰度的差异被记录为Δ2；(3)FPKM值的倍增变化(Δ2-Δ1)记录为叶片的黄瓜DEGs；(4)转录本丰度差异为|log2(Δ2-Δ1)|2或|log2(Δ2-Δ1)|-2的基因分别为上调基因或下调基因。

6.如权利要求1所述的转录组及代谢组鉴定南瓜运输mRNA响应低温代谢机制的方法，其特征在于：步骤7)中，差异强度代谢物计算方法如下：(1)在对照条件下，异源嫁接植物和同源嫁接植物的相同组织之间的离子强度值的差异被记录为Δ3；(2)在6h低温处理条件下，异源嫁接植物和同源嫁接植物之间的离子强度值的差异记录为Δ4；(3)低温处理条件下与对照条件下的最终差值为异源嫁接在低温处理下的倍数变化，被记录为(Δ4-Δ3)；(4)|log₂(Δ4-Δ3)|2或|log2(Δ4-Δ3)|-2的代谢物分别被鉴定为上调或下调的差异强度代谢物。