[发明专利]一种基于扩增子测序的提高引物均一性的方法

说明书

本发明提供了一种提高基于扩增子测序的引物扩增均一性的方法，主要通过在文库构建前对DNA样本先进行高温孵育，不仅可以打开FFPE DNA样本分子间的交联，而且也能解开基因组DNA复杂的多级空间结构，从而使所有引物与DNA模板更充分的结合，提高引物的扩增效率，缩小引物间扩增的差异，进而提高引物扩增的均一性。该方法操作流程简单，成本更低。

技术领域

本发明涉及基因测序领域，特别是涉及一种基于扩增子测序的提高引物均一性的方法。

背景技术

FFPE(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE)为福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本，同时也是在实体瘤研究中的重要样本来源，其十分珍贵且不可替代，随着NGS(Next-generation sequencing，NGS)技术的快速发展，从FFPE样本中分离纯化核酸进行后续的研究逐渐成为重要手段。但由于FFPE样本的特点，在进行福尔马林固定时容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程又进一步加速核酸的降解，以及样本可能在非理想条件下长时间存储，进而使如何从FFPE组织样本中提取符合下游NGS测序质量要求的DNA(Deoxyribo Nucleic Acid，DNA)变成一种挑战。

测序结果的好坏，最重要的影响因素就是DNA的质量，FFPE样本的DNA质量会显著影响后续二代测序文库的构建成功率和测序数据指标，所以从FFPE样本中提取出高质量的DNA尤为重要。通常，FFPE样本核酸提取实验包括以下流程：脱蜡和水化、酶消化组织、解交联、核酸提取，FFPE样本提取出来的DNA质量一般都比较差，主要体现在以下方面：DNA总量少、存在不同程度的降解、存在CT/GA等碱基替换造成检测结果的假阳性等。

FFPE样本在制备和保存过程中会使得基因组DNA发生一定程度的损伤，比如缺口、胞嘧啶(C)脱氨基为尿嘧啶(U)等，从而影响点突变(Indel)和单核苷酸变异(SingleNucleotide Variant，SNV)检测效果。为了提高文库质量，可以将DNA先用特定的酶混合物进行修复，然后应用于扩增子建库测序。但是FFPE样本的DNA通常存在总量不足、降解的问题，会严重影响有效模板量，有效模板量降低，即文库的有效库容减少，会影响目标区域的覆盖度(Coverage)、均一性(Uniformity)以及冗余度(Redundancy)。

扩增子测序(Amplicon Sequencing)是一种高靶向性方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异。随着高通量测序技术的发展，测序成本的降低，使测序技术逐渐成为基础生物学研究和医学检测的常规实验方法。从人类基因组计划构建了第一个基因组图谱开始，新一代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的高速发展。但全基因组测序结构复杂，数据量大，周期长，费用高，限制了它的发展；同时，有的研究者只对特定的基因组区域感兴趣，这时就只需对相应区域进行测序研究，不需要对全基因组进行测序。扩增子测序就是只对目标区域进行测序研究的一项测序方法，通过设计感兴趣的基因组区域的引物，进行PCR(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增，对目标区域进行富集，然后针对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行建库，高通量测序，分析序列中的变异。扩增子测序能根据研究者目的，针对目标区域进行高覆盖度的测序，还可以检测到低频突变。采用扩增子测序，研究者可以对基因组中感兴趣的关键区域进行重点研究，这种高针对性的方法可以高效的发现、验证和筛选关注区域的基因组变异。相比全基因组测序，扩增子测序对目标区域有更准确、快速的研究，适用于大量样本的特定基因组区域研究。

当前使用扩增子测序技术对抽提得到的FFPE DNA样本直接用于扩增子建库测序。但是，由于FFPE样本在制备和保存过程中福尔马林固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，使得在一定投入量的建库条件下，引物池与DNA模板结合的机会不均一，从而会导致引物均一性差，覆盖度不均匀,同时，扩增子测序的建库技术，通常会使用较多的引物，极易生成大量引物二聚体，也会增加操作的繁琐程度及检测样本的需求量。