[发明专利]一种快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法

说明书

本发明公开了一种快速高效的DNA5’侧翼序列克隆方法，包括以下2个主要步骤：(1)待测样本为模板，通过不同LAD引物组合与基因特异性R引物配对，使用热不对称交错PCR的方法进行第一轮PCR扩增；(2)以不同稀释倍数的第一轮PCR扩增产物作为模板，结合巢式PCR的引物设计方法，使用通用引物AC1与设计在第1轮特异性R引物上游的不同基因特异性R引物配对，通过热不对称交错PCR的方法进行第二轮PCR扩增。配合判断方法能够快速鉴别正确扩增条带范围，在原HiTail‑PCR的基础上由3轮扩增缩减为2轮扩增，且可由特异引物之间的已知间隔距离快速锁定特异扩增并排除部分非特异扩增，大幅减少非特异扩增带来的干扰。

技术领域

本发明属于侧翼序列克隆技术领域，具体涉及一种快速高效的DNA 5’侧 翼序列克隆方法。

背景技术

染色体步移技术(Genome Walking)是一种重要的分子生物学研究技术， 使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的5’端未知序列。染色体步移技术 主要有以下几方面的应用：

1.根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基 因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研 究；

2.获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；

3.鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导 致的外源基因的插入位点等；

4.用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；

5.用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。

对于基因组测序已经完成的少数物种来说，可以轻松地从数据库中找到某 物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数基因组信息未知的生物而言，想 要知道一个已知区域5’端的DNA序列，只能采用染色体步移技术。

由于染色体步移使用AP引物的局限性，在每一轮扩增中，均可能产生较短 或者新的非特异扩增，通过巢式PCR的方法不能完全消除非特异扩增结果。针对 上述问题，Liu和Chen发明了HiTail-PCR的方法，很大程度上消除了特异性短片 段的扩增和部分非特异扩增(Liu YG,Chen Y.High-efficiency thermal asymme tric interlaced PCR foramplification of unknown flanking sequences.BioTechn iques,2007,43(5):649-650,652,654passim.)。尽管HiTail-PCR技术的出现弥 补了普通染色体步移的部分缺陷，但是仍旧存在效率不高及步骤繁琐的问题。

因此，如何提供一种快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法是本领域亟待 解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速高效的DNA 5’侧翼序列克隆方法，包括以下步骤：

(1)以待测样本为模板，使用LAD引物组分别与SP1引物进行热不对称P CR扩增；

所述LAD引物组至少需要4个LAD引物，且两两配对；

(2)将(1)中扩增产物为模板，使用AC1依次与其余SP引物进行热不 对称PCR扩增；

所述SP引物组需要设计至少2个SP引物进行2组及以上扩增；

优选的，还包括特异性扩增条带的判断：步骤(2)中AC1与SP的扩增产 物，若不同组合扩增出大小相同的条带，则一定为非特异扩增；