[发明专利]一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用，属于生命科学和生物技术领域。TBC1D8B基因的特异性靶位点sgRNA，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的sgRNA3和核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的sgRNA14。本发明将合成的sgRNA和Cas9 mRNA以及打靶载体导入小鼠受精卵中，培育，筛选及交配，获得TBC1D8B基因敲除的小鼠动物模型。

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，具体涉及一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用。

背景技术

Homo sapiens TBC1 domain family,member 8B(英文全称，TBC1D8B)基因定 位于人的Xq22.3，编码一个具有TBC(Tre-2/Bub2/CDC16)结构域的蛋白质。一些 具有此结构域的哺乳动物蛋白通过与特定Rab蛋白结合并影响其GTPase活性而发挥 功能。小鼠TBC1D8B基因在X染色体正链上，全长69.3kb，NCBI ID：245638。该 基因在人类基因组中有两个转录本，在小鼠基因组中有一个转录本。

TBC1D8B隶属的TBC结构域家族蛋白在细胞生化过程中具有重要的作用，如承 担真核生物中包括内吞作用的囊泡运输功能，参与了肾小球过滤、蛋白质运输等生理 过程，除了作为GAP负调控Rab，还具有钙离子调控功能。近年来的一些研究发现， TBC1D8B基因在哺乳动物中高度保守，可显著促进细胞增殖和DNA合成，加速细胞 周期进程，提高细胞迁移和浸润能力，具有原癌基因的特征，有可能是一个新的原癌 基因。有研究证明，TBC1D8B的缺失或异常与肾病综合征的发生和发展有关。但目 前并没有相关的小鼠动物模型可以对其进行具体的研究。但是目前关于TBC1D8B的 作用机理研究并不深刻，且也没有相关的动物模型对其进行具体的研究。

CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术， CRISPR/Cas9基因编辑技术是继锌指核酸酶(ZFN)技术、TALEN基因编辑技术之后又 一重大突破。该技术通过RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA编辑。 CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率更高，Cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，并 已应用在各物种中，是目前使用广泛的基因编辑技术。通过导向RNA(sgRNA)介导核 酸内切酶Cas9蛋白进行目标DNA序列识别并造成DNA双链断裂，促进以同源重组 或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而对目标位点实现基因的定点敲入、以及 基因修正等多种修饰。使用CRISPR/Cas9技术进行基因敲入需要两个关键因素，首先 是有效的sgRNA引导序列，再就是Cas9蛋白的存在。然而CRISPR技术在营造全身 性基因敲除小鼠时存在一些无法忽视的缺陷。全身性基因敲除小鼠有时回因为该基因 对胚胎发育的影响而无法正常分娩；或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡；或者因 为不能产生后代而无法获取纯合子。此外，靶基因的sgRNA的设计方法虽然为本领域常规技术，但设计的针对不同位点的sgRNA存在打靶效率的差异，这无疑限制了 TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于打靶TBC1D8B基因的sgRNA，具有较 高的打靶效率。

本发明的目的在于提供一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法，成功构建了TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型，为后续筛查防治肾病综合征和/或研究肾病综 合征发生发展病程提供动物材料。

本发明提供了一种TBC1D8B基因的特异性靶位点sgRNA，包括sgRNA3和 sgRNA14；

所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述sgRNA14的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

本发明提供了一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：