[发明专利]一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)合成有活性的TBC1D8B基因的特异性靶位点sgRNA和Cas9mRNA；

所述sgRNA包括sgRNA3和sgRNA14；所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述sgRNA14的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；

2)构建TBC1D8B基因敲除的打靶载体；

3)将步骤1)中所述sgRNA和Cas9mRNA以及步骤2)中所述打靶载体导入小鼠受精卵中，培育并传代，获得TBC1D8B基因敲除的小鼠动物模型；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制；

步骤3)中所述sgRNA、Cas9mRNA和打靶载体的拷贝数比为(1～1.2)：(2～3)：(1～1.2)；所述sgRNA中sgRNA3和sgRNA14的拷贝数比为1：(1～1.2)；

步骤2)中构建TBC1D8B基因敲除的打靶载体的方法，包括以下步骤：将TBC1D8B基因上游同源臂片段LR、TBC1D8B基因下游同源臂片段RR和点突变的序列片段A通过克隆到表达载体上，构建获得打靶载体；

TBC1D8B基因上游同源臂片段LR的扩增引物包括EGE-YMX-004-A-LR-F和EGE-YMX-004-A-LR-R；所述EGE-YMX-004-A-LR-F的核苷酸序列如SEQIDNO:17所示；所述EGE-YMX-004-A-LR-R的核苷酸序列如SEQIDNO:18所示；

TBC1D8B基因下游同源臂片段RR包括EGE-YMX-004-A-RR-F和EGE-YMX-004-A-RR-R；所述EGE-YMX-004-A-RR-F的核苷酸序列如SEQIDNO:21所示；所述EGE-YMX-004-A-RR-R的核苷酸序列如SEQIDNO:22所示；

点突变的序列片段A的扩增引物包括EGE-YMX-004-A-A-F和EGE-YMX-004-A-A-R；所述EGE-YMX-004-A-A-F的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示；所述EGE-YMX-004-A-A-R的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述表达载体包括pCS-4G载体。

3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述传代是所述传代是阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代阳性小鼠相互杂交，获得的F2阳性小鼠与组织特异性Cre小鼠交配，筛选获得纯合子小鼠。

4.权利要求1～3中任意一项所述构建方法获得的TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型在制备筛查防治肾病综合征和/或研究肾病综合征发生发展病程的实验材料中的应用。