[发明专利]一种监测浓香型大曲制曲过程微生物生长代谢的方法

权利要求书

1.一种监测浓香型大曲制曲过程微生物生长代谢的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：收集样品并且检测基础数据：在发酵曲房的不同位置采集大曲发酵过程中不同时间内的大曲样本，并对采集的样品分别进行风味物质成分测定以及细菌和真菌属结构数据，获得动态变化结果；

步骤二：基于16S和ITS扩增子的微生物多样性PCoA主坐标分析：运用R语言将前缓、中挺、后缓落不同发酵时期的样品聚类，从而明确各阶段细菌、真菌属组成特征；

步骤三：基于LEfSe的微生物差异分析：首先使用非参数Kruskal-Wallis 秩和检验来验证不同阶段大曲中丰度差异显著的物种，然后使用Wilcoxon检验上一步的差异物种在不同阶段的差异一致性，最后采用线性回归分析来估算每个物种丰度对差异效果影响的大小；从而找到大曲发酵各阶段在丰度上有显著差异的特征物种，即biomaker；

步骤四：对前缓、中挺、后缓落各阶段特征风味物质聚类：运用simca软件，基于测定得到的风味物质成分，对浓香型大曲前缓、中挺、后缓落几个阶段进行聚类分析，并对风味物质进行有监督的正交偏最小二乘判别分析，获得每个发酵阶段的特征风味物质；

步骤五：对特征微生物与特征风味物质进行相关性分析：运用spss软件对前缓、中挺、后缓落各阶段特征微生物与特征风味物质进行基于斯皮尔曼系数的相关性分析并作双尾检验；用R语言绘制相关性聚类热图，进一步展示两者在浓香型大曲发酵过程中的相关关系；筛选拥有极显著相关性的特征微生物与特征风味物质，运用Gephi软件绘制相关性网络图；结合网络分析结果，找出前缓、中挺、后缓落各阶段与特征微生物极显著相关的风味物质，在实际生产中通过检测这些特征风味物质的含量来确定与他们极显著相关的特征微生物的含量，从而建立一种浓香型大曲制曲过程阶段性特征微生物生长代谢的判断方法；步骤二的具体步骤为，运用R语言和Galaxy分别对浓香型大曲发酵过程中的微生物进行聚类分析和线性判别分析，从而对发酵各阶段微生物进行聚类分析，从结果找到不同发酵阶段的微生物的组成中有明显差异性的地方，进一步通过线性判别分析，可以找到大曲发酵各阶段的特征微生物，前缓期为根霉属、链霉菌属、曲霉属、糖多孢菌属、假丝酵母属、新丝酵母属，中挺期为热子囊菌属、热放线菌属、气单胞菌属、黄杆菌属、克罗彭斯特菌属，后缓落期为芽孢杆菌属、嗜热真菌属、不动杆菌属、亚隔孢壳属。

2.如权利要求1所述一种监测浓香型大曲制曲过程微生物生长代谢的方法，其特征在于：步骤一中，从制曲开始计，大曲样本的取样时间分别取为0d、6d、16d和29d，且每个时间点做四组平行样；取样位置为从曲房四个顶点以及中心位置自上而下取大曲样品，总共16个大曲样品。

3.如权利要求1所述一种监测浓香型大曲制曲过程微生物生长代谢的方法，其特征在于：步骤一中所述的风味物质包括有机酸和挥发性风味物质；

检测方法为，利用高效液相色谱技术分别测定大曲发酵过程中的有机酸的动态变化，以峰面积外标法进行定量；运用顶空固相微萃取-气质谱联用技术分析不同发酵时期大曲样品的挥发性风味物质变化，将获得的挥发性成分与NIST library库进行比对分析，对匹配度80的确定其种类，通过内标法进行定量。

4.如权利要求1所述一种监测浓香型大曲制曲过程微生物生长代谢的方法，其特征在于：步骤一中所述的细菌属结构数据是指采用改良的CTAB提取法提取样品总DNA，用Illumina MiSeq平台进行高通量测序，得到各微生物多样性指数。